遺傳工程課件

遺傳工程一遺傳工程的概念1廣義：包括基因工程，細(xì)胞工程，染色體工程，細(xì)胞器工程等。2狹義：基因工程：按照人們預(yù)先設(shè)計(jì)的方案，借助于實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，將一種生物的基因或基因組轉(zhuǎn)移到另一種生物細(xì)胞中去，并使后者定向地獲得新的遺傳性狀，從而使生物基因組得到改造的技術(shù)。

基因工程的基本步驟（主要）（1）

準(zhǔn)備材料：目的基因，載體和工具酶等。（2）

目的基因與載體結(jié)合形成重組DNA分子。（3）

重組DNA分子引入受體細(xì)胞，并克隆。（4）

篩選目的基因在受體細(xì)胞能夠正確表達(dá)的無性繁殖系。二基因工程的操作（一）目的基因的分離1鳥槍法（SHOTGUN）鳥槍射擊法將含有目的基因的基因組DNA，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割成片段，再與載體進(jìn)行體外重組，（質(zhì)粒，或酵母人工染色體）形成重組DNA分子，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，形成基因文庫，然后用探針釣取目的基因。目前也有的用mRNA分離法，轉(zhuǎn)座子示蹤法及T-DNA插入突變法和圖譜克隆法。2化學(xué)合成法根據(jù)DNA堿基互補(bǔ)原則（根據(jù)）按照目的基因的核苷酸順序，利用連接酶，將單核苷酸或寡核苷酸片段一個(gè)個(gè)地連接起來，配成雙鏈。（二）載體與工具酶1載體A.要求能獨(dú)立自我復(fù)制，拷貝數(shù)較多。B.有多種限制酶的酶切位點(diǎn)，每種E最好只有一個(gè)切點(diǎn)，（酶切后）插入外源DNA后不影響其自我復(fù)制能力及選擇標(biāo)記基因。C.具有作為重組DNA分子的選擇的遺傳標(biāo)記。質(zhì)粒是一種細(xì)菌染色體以外的遺傳單元，如F因子，R因子，colE1因子等噬菌體也是一種好的載體，如入噬菌體（50kb）病毒

SV40寄生在靈長類的細(xì)胞中的一種病毒，具有自我復(fù)制及整合能力的DNA分子，一直被認(rèn)為是動物基因工程的理想載體。工具酶限制性內(nèi)切酶根據(jù)限制性內(nèi)切酶的切割特點(diǎn)進(jìn)行分類，可分為兩類:割部位無特異性的酶，能切斷DNA分子中雙鏈，需要ATP，Mg++，S-腺苷甲硫氨酸等輔助因子。例如，EcoB和EcoK，由于切割部位不固定.切割部位具有特異性的酶，能切斷雙鏈，能識別特定的堿基序列，切割部位具有特異性，需要Mg++作輔助因子，是遺傳工程中采用最多的一種酶。EcoRI，嗜血桿菌的HindⅢ這一類切內(nèi)酶多數(shù)具有粘性未端.

（三）重組DNA分子的構(gòu)建若目的基因和載體基因采用同一種能產(chǎn)生粘性未端的切內(nèi)酶切割，二者具有互補(bǔ)的粘性末端，采用DNA連接酶（T4DNA連接酶）連接起來。平齊未端的連接，采用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，在末端添加單核苷酸，在一個(gè)DNA片段上添加多聚T，另一個(gè)片段上添加多聚A，從而使二者粘性末端互補(bǔ)，再通過連接E連接起來。（四）外源DNA引入受體細(xì)胞進(jìn)行克隆

及篩選DNA理化轉(zhuǎn)移方法（無載體基因工程）主要方法有：

A.PEG（聚乙二醇）法，使DNA沉淀，剌激細(xì)胞內(nèi)攝，原生質(zhì)體無損傷，通過重組整合實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。B.電融合法，電脈中使原生質(zhì)膜產(chǎn)生瞬時(shí)孔洞，使DNA進(jìn)入細(xì)胞。C.微注射法，在顯微鏡下，用玻璃毛細(xì)管直接將DNA注射到受體核內(nèi)。D.基因槍法，是將DNA附著在鎢彈或金彈粒子（1-3μm）表面，借助爆炸力或電子沖擊波打入細(xì)胞。E.碳化硅纖維介導(dǎo)DNA法。F.花粉管通道法，指植物授粉2-24小時(shí)，外源DNA能沿尚未關(guān)閉的花粉管通道進(jìn)入細(xì)胞。載體法

重組DNA引入受體細(xì)胞，因所用載體不同而采用不同的方法。以質(zhì)粒為載體——轉(zhuǎn)化，而以噬菌體為載體——轉(zhuǎn)染，但二者無本質(zhì)的區(qū)別，都是把外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。成功的關(guān)鍵有三個(gè)條件A外源DNA必須是雙鏈。B合適的受體細(xì)胞。C感受態(tài)的受體細(xì)胞。同時(shí)要求外源DNA要有一定的濃度。CaCl2和熱擊處理（42-45℃）。

重組體的選擇主要是通過選擇標(biāo)記基因進(jìn)行篩選，如大多數(shù)載體都帶有抗藥性的選擇重組體。而目的基因是否存在，還要通過探針進(jìn)行原位分子雜交來加以選擇。（五）基因的表達(dá)

選用適宜的啟動子如植物基因工程中應(yīng)用較好啟動子主要有CaMV35S（花椰菜花葉病毒）玉米Adh-1，果蠅copia等。目的基因整合位置和方向也與表達(dá)有關(guān)。三植物細(xì)胞工程