胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)專家講座

三、胚胎分割優(yōu)勢(shì):可成倍增加胚胎數(shù)量，能夠快速繁殖良種畜。概念:將早期胚胎切割成2等份，4等份或8等份等，經(jīng)移植取得同卵雙胎或多胎技術(shù)。胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第1頁(yè)一）胚胎分割技術(shù)研究概況胚胎分割技術(shù)開始于Nicholas（1942）對(duì)大鼠2-細(xì)胞卵裂球分離和培養(yǎng)。其后,Tarkowski等研究了小鼠1/4,2/4,3/4卵裂球發(fā)展規(guī)律,得到了世界上首例半胚起源活體動(dòng)物。20世紀(jì)70年代以來(lái),伴隨胚胎培養(yǎng)及移植技術(shù)發(fā)展和提升,哺乳動(dòng)物胚胎分割技術(shù)取得了突破性進(jìn)展。當(dāng)前胚胎分割研究方向也正向著簡(jiǎn)單化和實(shí)用化發(fā)展。我國(guó)1986年張涌等首次利用胚胎分割方法取得同卵雙生小鼠,1987年又取得同卵雙生山羊。1986年竇忠英等取得分割胚牛犢,1990年又取得奶牛四分胚后代。1987年譚麗玲等取得同卵雙生犢。胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第2頁(yè)胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第3頁(yè)特點(diǎn):后代含有相同遺傳物質(zhì)，克隆選擇胚胎:發(fā)育良好，形態(tài)正常桑椹胚或囊胚使用主要儀器:體視顯微鏡、顯微操作儀、切割刀、切割針注意:將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分裂胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第4頁(yè)二）胚胎分割基本程序切割器具準(zhǔn)備；胚胎預(yù)處理；胚胎分割；分割胚培養(yǎng)；分割胚移植；胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第5頁(yè)1.切割器具體視顯微鏡；顯微操作儀；胚胎固定管；胚胎分割針；胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第6頁(yè)2.胚胎預(yù)處理用鏈霉蛋白酶處理鏈霉蛋白酶作用:使透明帶軟化、變薄或去除胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第7頁(yè)3.胚胎分割方法酶解法:用鏈霉蛋白酶處理機(jī)械法:用分割針切開透明帶胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第8頁(yè)胚胎分割基本操作選擇良好桑椹胚或囊胚移入培養(yǎng)皿中,用分割針或分割刀片將其切開,吸出其中半個(gè)胚胎注入透明帶中或直接移植給受體。胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第9頁(yè)胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第10頁(yè)4.分割胚培養(yǎng)；

原因:早期胚胎切割后發(fā)育能力低，普通是經(jīng)包埋后移植到中間受體輸卵管中培養(yǎng)幾天至囊胚，再?gòu)妮斅压苤谢厥张咛?，最終移植給受體。方法:體外培養(yǎng)體內(nèi)培養(yǎng)（需瓊脂包埋）胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第11頁(yè)瓊脂包埋作用固定胚胎便于回收胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第12頁(yè)分割胚移植要求:胚胎分割后能夠直接移植給受體,也能夠進(jìn)行超低溫冷凍保留。為提升冷凍胚胎移植后受胎率,分割胚胎需要在體內(nèi)或體外培養(yǎng)到桑椹或囊胚階段,再進(jìn)行冷凍。胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第13頁(yè)三）胚胎分割技術(shù)應(yīng)用應(yīng)用:在畜牧方面:擴(kuò)大優(yōu)良家畜數(shù)量在研究方面:培養(yǎng)遺傳特征相同試驗(yàn)動(dòng)物性別判定存在問(wèn)題:如:早期胚胎細(xì)胞分化和定位發(fā)育機(jī)制不一樣階段胚胎細(xì)胞分化時(shí)間和發(fā)育潛力胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第14頁(yè)受精卵分裂

早期胚胎胚胎分割基本過(guò)程代孕母牛植入植入分割胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第15頁(yè)胚胎分割基本過(guò)程胚胎移入培養(yǎng)液分割胚胎（機(jī)械法、酶處理）移植胚胎給受體著床產(chǎn)仔胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第16頁(yè)四、胚胎干細(xì)胞核移植技術(shù)1.概念:（胚胎干細(xì)胞）:簡(jiǎn)稱ES或EK細(xì)胞，是由早期胚胎或原始性腺中分離出來(lái)一類細(xì)胞。胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第17頁(yè)2.特點(diǎn):1)形態(tài):體積小、細(xì)胞核大、核仁顯著。2)功效:含有發(fā)育全能性；是一個(gè)高度未分化細(xì)胞，可分化為成年動(dòng)物體內(nèi)任何一個(gè)組織和器官。3）應(yīng)用:在體外培養(yǎng)條件下，能夠增殖而不發(fā)生分化；對(duì)它能夠進(jìn)行冷凍保留，也能夠進(jìn)行遺傳改造。3.主要用途:(1)治療人類一些頑癥(2)培育出人造組織器官，用于器官移植(3)是研究體外細(xì)胞分化理想材料胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第18頁(yè)一）胚胎干細(xì)胞核移植程序喂養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)體系建立胚胎干細(xì)胞取得胚胎干細(xì)胞核移植胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第19頁(yè)1.喂養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)體系建立喂養(yǎng)層培養(yǎng)體系組成胚胎成纖維細(xì)胞作用:抑制細(xì)胞分化成纖維細(xì)胞（fibroblast）:是疏松結(jié)締組織主要細(xì)胞成份，由胚胎時(shí)期間充質(zhì)細(xì)胞(mesenchymalcell)分化而來(lái)。細(xì)胞較大，輪廓清楚，多為突起紡錘形或星形扁平狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核卵圓形，核仁大而顯著。細(xì)胞功效活動(dòng)旺盛，細(xì)胞質(zhì)弱嗜堿性，具顯著蛋白質(zhì)合成和分泌活動(dòng)。成纖維細(xì)胞對(duì)不一樣程度細(xì)胞變性、壞死和組織缺損以及骨創(chuàng)傷修復(fù)有著十分主要作用。喂養(yǎng)層細(xì)胞（feederlayer）:在正常機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞除了取得一些血液來(lái)營(yíng)養(yǎng)外，還在細(xì)胞與細(xì)胞之間交換特殊物質(zhì)，用于分裂分化和營(yíng)養(yǎng)等。因而，在細(xì)胞體外培養(yǎng)中，除了正常培養(yǎng)基外，先培養(yǎng)一層特殊細(xì)胞，然后再在其上接種要試驗(yàn)細(xì)胞，這么更能模擬體內(nèi)環(huán)境。這些特殊細(xì)胞就是喂養(yǎng)層細(xì)胞，通常是成纖維類細(xì)胞，這些細(xì)胞能夠提供試驗(yàn)細(xì)胞更加好營(yíng)養(yǎng)，有分化研究則是必須有喂養(yǎng)層細(xì)胞。胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第20頁(yè)2.胚胎干細(xì)胞取得時(shí)期:囊胚或囊胚期以前如小鼠:桑椹胚、囊胚人體:囊胚、原始生殖細(xì)胞培養(yǎng):置于含喂養(yǎng)層培養(yǎng)液中培養(yǎng)方法:原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)作用:抑制胚胎干細(xì)胞分化胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第21頁(yè)胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第22頁(yè)3.胚胎干細(xì)胞核移植指把胚胎干細(xì)胞核移植到去核卵細(xì)胞中,經(jīng)過(guò)胚激活、胚胎培養(yǎng)、胚胎移植后直接由受體完成克隆動(dòng)物技術(shù)。胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第23頁(yè)胚胎干細(xì)胞核移植:

胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第24頁(yè)二）胚胎干細(xì)胞應(yīng)用培養(yǎng)克隆動(dòng)物核供體取得基因敲除動(dòng)物治療性克隆胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第25頁(yè)1.以下相關(guān)動(dòng)物胚胎移植敘述中,錯(cuò)誤是A.受孕母畜體內(nèi)受精卵或胚胎均能移植B.受體母畜必須處于與供體母畜同時(shí)發(fā)情狀態(tài)C.超數(shù)排卵技術(shù)要使用一定激素D.試管嬰兒只是受精及早期卵裂過(guò)程在試管中進(jìn)行2.以下對(duì)于優(yōu)良種畜胚胎移植說(shuō)法不正確是A.供體母牛必須是同一物種良種B.受體母牛必須是同一物種良種C.供體公牛必須是同一物種良種D.受體母牛能夠是同一物種普通健康牛練習(xí):胚胎胚胎工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)第26頁(yè)3.供體胚胎移植到受體后,游離胚胎在發(fā)育過(guò)程中形成胎盤與受體相連,并經(jīng)過(guò)胎盤與受體血液進(jìn)行物質(zhì)交換。以下說(shuō)法正確是A.受體是為供體胚胎提供發(fā)育條件B.受體與胚胎血型應(yīng)相同,不然會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)C.受體與胚胎血液混融在一起D.胚胎心肺功效都