《植物生物技術(shù)概論》2課件

第二章基因工程1《植物生物技術(shù)概論》22《植物生物技術(shù)概論》2基因工程(geneengineering)的概念基因工程也叫基因操作、遺傳工程，或DNA重組技術(shù)。是按人們的需要，用類似工程設(shè)計的方法將不同來源的基因（DNA分子），在體外構(gòu)建成雜種DNA分子，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、表達的操作。優(yōu)點：打破了常規(guī)育種難以突破的物種之間的限制。3《植物生物技術(shù)概論》2理論依據(jù)不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)基因是可切割的基因是可以轉(zhuǎn)移的多肽與基因之間存在對應(yīng)關(guān)系遺傳密碼是通用的基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代4《植物生物技術(shù)概論》2基因工程的基本過程它所涉及的過程可用“分(合成)、切、連、轉(zhuǎn)、選、鑒”六個字表示。分(合成)∶指DNA的制備，包括從生物體中分離或人工合成。切∶即在體外將DNA進行切割，使之片段化或線性化。連∶即在體外將不同來源的DNA分子重新連接起來，構(gòu)建重組DNA分子。轉(zhuǎn)∶即將重組連接的DNA分子通過一定的方法重新送入或細(xì)胞中進行擴增和表達。選∶從轉(zhuǎn)化的全群體中將所需要的目的克隆挑選出來；鑒∶就是進行對篩選出來的重組體進行鑒定5《植物生物技術(shù)概論》2基因克隆示意圖6《植物生物技術(shù)概論》2第一節(jié)DNA重組技術(shù)7《植物生物技術(shù)概論》2一、DNA的結(jié)構(gòu)與功能8《植物生物技術(shù)概論》2脫氧核糖核苷酸分子由脫氧核糖、堿基和磷酸基團（base）組成。1.組成9《植物生物技術(shù)概論》2多個脫氧核苷酸按此方式連接成多聚脫氧核苷酸，其一端為游離的5’磷酸基團(5'-P)，稱為5’端，而另一端為游離的3’羥基(3'-OH)，稱為3’端。10《植物生物技術(shù)概論》2Chargaff規(guī)則的內(nèi)容所有DNA：A=T、G=C，即A+G=T+C。DNA的堿基組成具有種的特異性，即不同種的DNA堿基組成不一樣。對同一生物物種，DNA的堿基組成沒有組織和器官的特異性。DNA的堿基組成不隨年齡、營養(yǎng)狀況及環(huán)境的改變而改變。11《植物生物技術(shù)概論》22.結(jié)構(gòu)（1）DNA的一級結(jié)構(gòu)脫氧核苷酸在長鏈上的排列順序就是DNA的一級結(jié)構(gòu)。不同種DNA之間的千差萬別只是在堿基排列順序不同。DNA的一級結(jié)構(gòu)也稱為核苷酸序列或堿基序列。12《植物生物技術(shù)概論》2（2）DNA的二級結(jié)構(gòu)DNA的二級結(jié)構(gòu)即DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型

(DNADoubleHelixModel).13《植物生物技術(shù)概論》21952.King’sLab.UKM.H.F.Wilkins&RosalindFrankinDNA的高質(zhì)量X射線衍射圖14《植物生物技術(shù)概論》21953.Watson&Crick

B-DNA的右手雙螺旋模型

15《植物生物技術(shù)概論》2DNA雙螺旋的結(jié)構(gòu)特點

l

兩股單鏈"糖-磷酸"構(gòu)成骨架，居雙螺旋外側(cè)。堿基位于雙螺旋內(nèi)側(cè)，并與中心軸垂直。l

每圈螺旋含10個核苷酸殘基，螺距：3.4nm,直徑:2nm。有兩個溝：大溝和小溝。l

堿基嚴(yán)格配對:A與T、C與G互補堿基與互補鏈。l

由兩條反向平行的脫氧多核苷酸鏈圍繞同一中心軸構(gòu)成右手雙螺旋結(jié)構(gòu)。16《植物生物技術(shù)概論》2影響雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的因素

氫鍵

(Hydrogenbond)弱鍵,可加熱解鏈.磷酸酯鍵

(phosphoesterbond),也叫離子鍵。強鍵,需酶促解鏈.堿基堆積力

(非特異性結(jié)合力).

☆磷酸骨架,氨基,酮基周圍水分子間的有序排列

☆Vandewaalsforce

☆疏水作用力(Hydrophobicinteraction)

17《植物生物技術(shù)概論》2Z-DNAZ-DNAA-DNAB-DNADNA的分子構(gòu)型（B/Z/A）比較18《植物生物技術(shù)概論》2

由于雙鏈DNA是靠互補配對的堿基之間的氫鍵維持的，因此當(dāng)溶解在溶液中的雙鏈DNA處于較高溫度條件下時，因氫鍵斷開而解鏈成單鏈DNA，此過程稱為DNA變性。

DNA溶液加熱到90℃時，就足以使DNA完全變性。高溫變性的DNA被逐漸冷卻時，分開的兩條單鏈又會重新結(jié)合成雙鏈DNA，此過程稱為復(fù)性。DNA的變性與復(fù)性19《植物生物技術(shù)概論》2DNA的變性與復(fù)性20《植物生物技術(shù)概論》2DNA分子雜交21《植物生物技術(shù)概論》2雙螺旋DNA進一步扭曲盤繞則形成其三級結(jié)構(gòu)，超螺旋是DNA三級結(jié)構(gòu)的主要形式。絕大多數(shù)原核生物都是共價封閉環(huán)(covalentlyclosedcircle,CCC)分子，這種雙螺旋環(huán)狀分子再度螺旋化成為超螺旋結(jié)構(gòu)(superhelix或supercoil)。超螺旋按其方向分為正超螺旋和負(fù)超螺旋兩種。（3）DNA的三級結(jié)構(gòu)22《植物生物技術(shù)概論》223《植物生物技術(shù)概論》2（1）DNA分子能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制以親代DNA的一條單鏈為模板，按照堿基互補原則，合成另一條具有互補堿基的新鏈。通過復(fù)制所形成的新DNA子鏈，含有原來親本DNA雙鏈分子的一條親代鏈和一條新的子代鏈，所以DNA這種自我復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。3.DNA的功能24《植物生物技術(shù)概論》225《植物生物技術(shù)概論》2DNA的功能——起著貯存和傳遞遺傳信息的作用。基因——基因就是DNA的功能片斷，或者說基因是一段DNA順序。（2）貯存和傳遞遺傳信息26《植物生物技術(shù)概論》2DNA的基本功能就是作為生物遺傳信息復(fù)制的模板和基因轉(zhuǎn)錄的模板，是生命遺傳繁殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個體生命活動的基礎(chǔ)。27《植物生物技術(shù)概論》2DNA體外重組，首先必須獲得重組和能夠重組的DNA片段。如何獲得DNA片段呢？二、限制性內(nèi)切酶與DNA片段化28《植物生物技術(shù)概論》2一把特殊的剪刀

——限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，獲1978年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎29《植物生物技術(shù)概論》230《植物生物技術(shù)概論》2限制性內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)是指一類能識別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并在合適反應(yīng)條件下使每一條鏈一定位點上的磷酸二酯鍵斷開，產(chǎn)生具有3’-OH基團和5’-P基團的DNA片段。內(nèi)切核酸酶有Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。1個單位限制性內(nèi)切酶是指在最適條件下，在50μl體積1小時內(nèi)完全切開1μg

λ噬菌體DNA所需的酶量。1.限制性內(nèi)切酶31《植物生物技術(shù)概論》2限制性內(nèi)切酶的種類32《植物生物技術(shù)概論》2（1）限制性核酸內(nèi)切酶的命名一般是以微生物屬名的第一個字母和種名的前兩個字母組成，第四個字母表示菌株(品系)。前三個字母必須是斜體。例如，從BacillusamyloliquefaciensH中提取的限制性內(nèi)切酶稱為BamH。在同一品系細(xì)菌中得到的識別不同堿基順序的幾種不同特異性的酶，可以編成不同的號，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboII等。EcoRⅠ(E：屬名；co：種名；R：株；Ⅰ：發(fā)現(xiàn)次序)。EcoR

IEscharichiacoliRy13first33《植物生物技術(shù)概論》2（2）識別序列限制性內(nèi)切酶可特異地結(jié)合于一段被稱為限制酶識別序列的DNA序列位點上并在此切割雙鏈DNA。絕大多數(shù)限制性內(nèi)切酶識別長度為6個核苷酸的特異序列，切割位點相對于二重對稱軸的位置因酶而異。少數(shù)限制性內(nèi)切酶的識別序列由4個或者5個核苷酸對組成。34《植物生物技術(shù)概論》235《植物生物技術(shù)概論》2（3）酶切位點DNA在限制性內(nèi)切核酸酶的作用下，使多聚核苷酸鏈上磷酸二酯鍵斷開的位置被稱為酶切位點，可用↓表示。一般酶切位點在識別序列內(nèi)部，如G↓GATCC；少數(shù)在識別序列兩側(cè)，如：↓GATC、CATG↓等。一些酶恰在對稱軸處同時切割DNA雙鏈而產(chǎn)生帶平端的DNA片段；另一些酶則在對稱軸兩側(cè)相對的位置上分別切斷兩條鏈，產(chǎn)生帶有單鏈突出端（即黏端）的DNA片段36《植物生物技術(shù)概論》2平末端與黏性末端37《植物生物技術(shù)概論》238《植物生物技術(shù)概論》239《植物生物技術(shù)概論》2反應(yīng)只需Mg2+的存在，并且具有以下兩個特點，使這類酶在基因工程研究中，得到廣泛的應(yīng)用。識別位點是一個回文對稱結(jié)構(gòu)，并且切割位點也在這一回文對稱結(jié)構(gòu)上。許多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成黏性末端，有利于DNA片段的重組。II型酶40《植物生物技術(shù)概論》2Ⅱ類酶識別序列特點41《植物生物技術(shù)概論》2

同裂酶（isoschizomers)：

指來源不同但識別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂酶對甲基化位點的敏感性不同。Example:限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一對同裂酶（CCGG)，當(dāng)靶序列中一個5-甲基胞嘧啶時HpaⅡ不能進行切割，而MspⅠ可以。同裂酶與同尾酶42《植物生物技術(shù)概論》2同尾酶（isocaudamer）序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點的選擇余地更大。43《植物生物技術(shù)概論》2三、特異DNA片段的PCR擴增PCR技術(shù)(Polymerase

ChainReaction):是在模板DNA、引物和四種dNTP

等存在的條件下,依賴于DNA聚合酶(Taq酶)的酶促合成反應(yīng)。其具體反應(yīng)分三步:

變性、退火、延伸。以上三步為一個循環(huán),經(jīng)25～30次循環(huán)DNA數(shù)量可達2×106～7拷貝數(shù)。44《植物生物技術(shù)概論》21983年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coliDNA聚合酶進行PCR耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎PCR技術(shù)的發(fā)明45《植物生物技術(shù)概論》2KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美國《Science》雜志列PCR

為十余項重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。46《植物生物技術(shù)概論》2PCR技術(shù)的反應(yīng)條件標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物

各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L47《植物生物技術(shù)概論》2(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的擴增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互補鏈引物1互補鏈單位長度的鏈不同長度的鏈5’3’3’5’引物1互補鏈引物2互補鏈目的片段（不同長度的鏈未示出）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖(e)(f)(g)48《植物生物技術(shù)概論》2溫度（℃）時間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期PCR反應(yīng)的每一個溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。49《植物生物技術(shù)概論》2反應(yīng)初期，目的DNA片段呈指數(shù)形式增加；隨著目的DNA的積累，在引物、模板與DNA聚合酶達到一定比例時，酶的催化反應(yīng)趨于飽和平臺期（25個循環(huán)）。50《植物生物技術(shù)概論》21.雙鏈DNA變性（一）PCR的反應(yīng)過程51《植物生物技術(shù)概論》22.引物與模板DNA退火52《植物生物技術(shù)概論》23.引物延伸DNA合成53《植物生物技術(shù)概論》24.第二輪循環(huán)的變性54《植物生物技術(shù)概論》25.第二輪循環(huán)的引物延伸DNA合成55《植物生物技術(shù)概論》256《植物生物技術(shù)概論》2PCR反應(yīng)的特點特異性強靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴增到微克(mg=10-6)水平簡便、快速：PCR反應(yīng)一般在2～4小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。對標(biāo)本的純度要求低不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及總RNA均可作為擴增模板。57《植物生物技術(shù)概論》2（二）RT-PCR（reversetranscriptionPCR）反轉(zhuǎn)錄PCR是一種從RNA擴增cDNA的方法。提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA；再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。58《植物生物技術(shù)概論》259《植物生物技術(shù)概論》2四DNA片段的化學(xué)合成利用DNA合成儀，根據(jù)待合成的DNA片段預(yù)定的核苷酸序列，可自動的將4種核苷酸單體按3’-5’磷酸酯鍵連接成寡核苷酸片段。合成引物合成DNA寡核苷酸連桿(linker)合成基因片段60《植物生物技術(shù)概論》2寡核苷酸連桿也稱為銜接物或接頭，是一種按預(yù)先設(shè)計，化學(xué)合成的寡核苷酸片段。有一種或幾種限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列，使連接了寡核苷酸連桿的DNA片段經(jīng)過這些限制性內(nèi)切核酸酶酶切后，可以產(chǎn)生一定的黏性末端，便于與具有相同黏性末端的另一DNA片段連接。61《植物生物技術(shù)概論》2有的寡核苷酸連桿超過100個核苷酸，其上有多種限制性內(nèi)切核酸酶識別序列，不僅可作為連桿，而且被組裝在克隆載體上成為多克隆位點(MCS)。這樣的連桿被稱為多克隆位點核苷酸連桿或簡稱MCS連桿。MCS連桿62《植物生物技術(shù)概論》2五DNA片段的連接重組DNA連接酶(DNAligase)

能催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3’-OH末端和5’-P末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接。目前用于試管中連接DNA片段的DNA連接酶E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。E.coliDNA連接酶只能催化雙鏈DNA片段互補黏性末端之間的連接；而T4DNA連接酶既可用于雙鏈DNA片段互補黏性末端之間的連接，也能催化雙鏈DNA片段平末端之間的連接。1.DNA連接酶63《植物生物技術(shù)概論》2DNA連接酶只能連接缺口（nick），不能連接裂口（gap）。而且被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。64《植物生物技術(shù)概論》2DNA連接酶利用NAD或ATP中的能量催化兩個核酸鏈之間形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶－－NAD+T4DNA連接酶－－ATP65《植物生物技術(shù)概論》2（1）具互補黏性末端片段之間的連接連接反應(yīng)可用E.coliDNA連接酶，也可用T4DNA連接酶；待連接的兩個DNA片段的末端如果是用同一種限制性內(nèi)切核酸酶酶切的，連接后仍保留原限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列。如果是用兩種同尾酶酶切的，雖然產(chǎn)生相同的互補黏性末端，可以有效地進行連接，但是獲得的重組DNA分子往往消失了原來用于酶切的那兩種限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列。2.DNA片段之間的連接66《植物生物技術(shù)概論》2BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGDNA連接酶GATCCGGCCTAG+重組體目的基因自連

載體自連2.DNA片段之間的連接（1）具互補黏性末端片段之間的連接《植物生物技術(shù)概論》2目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切