H5和H9亞型禽流感病毒壓電免疫傳感器和超敏熒光試紙條檢測(cè)方法

5器材和設(shè)備5.1壓電芯片蛋白測(cè)定儀。5.2熒光免疫層析試紙條檢測(cè)儀。5.3電熱恒溫水浴鍋。5.4組織研磨器。5.5低溫高速離心機(jī)。5.6計(jì)時(shí)器。6.1樣品的采集6.1.1禽流感樣品采樣應(yīng)按照GB/T18088中的規(guī)定采樣，并按照相關(guān)規(guī)定做好生物安全防護(hù)。6.1.2將棉拭子插入禽類的咽喉、肛門(mén)或者糞便中左右攪動(dòng)。取出后放入含2mL樣品處理液的離心管中混勻，可直接用于檢測(cè)。也可直接采取待檢組織，不少于2g,放置于無(wú)菌容器中。樣品采集后，放入密閉的樣品袋內(nèi)(一個(gè)采樣點(diǎn)的樣品，放一個(gè)樣品袋),于保溫箱中加冰、密封，送實(shí)驗(yàn)室。將棉拭子與2mL樣品處理液充分混勻，編號(hào)備用?；蛑苯佑?mL組織樣品處理液懸浮0.5g待檢組織樣品，研磨均勻后，10000r/min離心5min,取上清用于檢測(cè)。6.4樣本存放制備的樣本在2℃-8C條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h,若需長(zhǎng)期保存應(yīng)置于-70℃以下，但應(yīng)避免反復(fù)凍融(凍融不超過(guò)3次)。7設(shè)立檢測(cè)對(duì)眼在樣品處理過(guò)程中必須設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，并與待檢樣品一起處理。1:64,由國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室提供。取正常的禽組織或或陰性尿囊液作為陰性對(duì)照。取等體積的樣品處理液作為空白對(duì)照。8壓電免疫傳感器檢測(cè)8.1從密封袋中取出H5或H9亞型禽流感病毒壓電免疫傳感器，將其恢復(fù)至室溫(20℃~25℃),8.2用磷酸鹽緩沖溶液(PBS0.02mol/L,pH7.2)緩慢滴加沖洗H5或H9亞型禽流感病毒壓電免疫傳感器3次，每次2min,再用雙蒸水緩慢滴加沖洗3次，低風(fēng)速吹干(不可加熱),于壓電芯片蛋白測(cè)定儀上測(cè)定諧振頻率F。8.3將經(jīng)過(guò)抗體包被的HS或H9亞型禽流感病毒壓電免疫傳感器浸泡于200μL~500μL待檢樣品溶8.4用磷酸鹽緩沖溶液(PBS0.02mol/L,pH7.2)緩慢滴加沖洗H5亞型禽流感病毒壓電免疫傳感器3次，每次2min,再用雙蒸水緩慢滴加沖洗3次，低風(fēng)速吹干(不可加熱),于壓電芯片蛋白測(cè)定儀8.5計(jì)算F與F?的差值△F,△F=F?-F?9.1從密封袋中取出H5或H9亞型禽流感病毒熒光免疫層析試紙條，將其恢復(fù)至室溫(20℃25℃),在30min內(nèi)使用。9.2取60μL處理后的樣品，逐滴加到試紙條上的樣品孔中。水平放置并計(jì)時(shí)9.3在10min~15min內(nèi)通過(guò)紫外燈觀察或者熒光免疫層析試紙條檢測(cè)儀觀察并記錄結(jié)果。超過(guò)20mim判讀結(jié)果無(wú)效陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)AF值，陽(yáng)性對(duì)照的AF值均應(yīng)=50?二者均成立才可判定試驗(yàn)成立，否則試驗(yàn)無(wú)效。在試驗(yàn)成立的條件下。待檢樣品檢測(cè)結(jié)果△F值≥40,判為H5或H9亞型禽流感病毒壓電免疫檢測(cè)結(jié)果無(wú)△F值，△f位4s、判為H5或H9亞型禽流感病毒壓電免疫傳感器檢測(cè)結(jié)果陰性檢測(cè)結(jié)果35≤AF值<40,判為可疑樣。對(duì)于可疑陽(yáng)性樣品，應(yīng)重新進(jìn)行一次HS或H9亞型禽流感病毒壓電免疫傳感器檢測(cè)或其他方法檢測(cè)，或者送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確證檢測(cè)。陽(yáng)性對(duì)照：在試紙條上出現(xiàn)兩條熒光條帶，一條位于測(cè)試區(qū)(T)。一條位于質(zhì)控區(qū)(C)。陰性對(duì)照和空白對(duì)照：在試紙條上僅出現(xiàn)一條熒光條帶，且位于質(zhì)控區(qū)(C)。二者均成立才可判定試驗(yàn)成立，否則試驗(yàn)無(wú)效。10.2.2陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果判定待檢樣品在試紙條上出現(xiàn)兩條熒光條帶，一條位于測(cè)試區(qū)(T),一條位于質(zhì)控區(qū)(C),判為H5或H9亞型禽流感病毒熒光免疫層析試紙條檢測(cè)陽(yáng)性，表明存在H5或H9亞型禽流感病毒。10.2.3陰性檢測(cè)結(jié)果判定待檢樣品在試紙條上出現(xiàn)一條熒光條帶，且位于質(zhì)控區(qū)(C),判為H5或H9亞型禽流感病毒熒光免疫層析試紙條檢測(cè)陰性，表明無(wú)H5或H9亞型禽流感病毒存在10.2.4可疑檢測(cè)結(jié)果判定待檢樣品在試紙條上出現(xiàn)兩條熒光條帶，且位于測(cè)試區(qū)(T)的條帶非常微弱，判為H5或H9亞型禽流感病毒熒光免疫層析試紙條檢測(cè)可疑。對(duì)于可疑陽(yáng)性樣品，應(yīng)重新進(jìn)行一次H5或H9亞型禽流感病毒熒光免疫層析試紙條檢測(cè)或其用他方法檢測(cè)，或者送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確證檢測(cè)。附錄A(規(guī)范性附錄)A.1棉拭子樣品處理液稱取磷酸氫二鈉(Na?HPO?)2.3g,磷酸二氫鈉(NaH?PO?·H?O)0.52g,氯化鈉(NaCI)8.77g,溶解于90mL去離子水中，調(diào)pH值為7.4后定容至1000mL。高壓滅菌后加入5gN-乙酰-L-半胱氨酸、5mLNP-40,混勻后分裝，置于4℃貯存，用于處理喉頭拭子、肛門(mén)拭子等樣品。A.2組織樣品處理液(PBS0.02m稱取磷酸氧二鈉(Na?HPO?