國境口岸鳥分枝桿菌PCR檢測方法

國境口岸鳥分枝桿菌PCR檢測方法本標準規(guī)定了國境口岸痰樣本中鳥分枝桿菌的PCR檢測方法。本標準適用于國境口岸入出境人員感染鳥分枝桿菌的檢測2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。SN/T1193基因檢驗實驗室技術要求人間傳染的病原微生物名錄(衛(wèi)生部)下列術語和定義適用于本文件包括鳥分枝桿菌亞種(M.miumswubo)、副結核亞種(M.penatutherculsisuhop)、Msilvatirumsauho3個亞種。鳥分枝桿菌為抗酸桿菌，菌體大小0.6μmx(137℃,羅氏培養(yǎng)基上培育7d或更長的時間，通常產生光滑無色素的菌落，老菌落可能變?yōu)辄S色。鳥分枝桿菌病Mycoberium.um由鳥分枝桿菌復合群感染引定的疾，感染后可侵害多種組織器官包括肺、骨髓、淋巴結等潤。鳥分枝桿菌引起的肺部病變是最常見的非結核分支桿菌肺病，其臨床表現、影像特點和病理變化類似肺結核，不做菌種鑒定，兩者容易混淆——鳥分枝桿菌相關的大量活菌培養(yǎng)和動物感染實驗操作應在生物安全二級(BSL-2或ABSL-2) 分枝桿菌相關的未經培養(yǎng)的感染性材料的操作在生物安全二級(BSL2)實驗室內進行： 鳥分枝枉菌相關的滅活材料的操作在生物安全一級(BSL-1)實驗室內進行： 名分枝枉菌的細菌培養(yǎng)物運輸包裝分類為B類，UN編號為3373—驗過程中的廢奔物，收集后進行高壓蒸汽滅菌，作為醫(yī)療廢棄物處理或其他等效的處理方法。5儀器和設備5.2PCR檢測儀。5.4水平凝膠電泳儀。5.5凝膠成像儀。5.6正置光學顯微鏡。5.7超純水器或雙蒸水器。5.8高壓滅菌鍋。5.9臺式高速冷凍離心機(RCF3500g以上)6試劑和耗材6.1羅氏培養(yǎng)基。6.2Middlehronk7H9培養(yǎng)基。6.7pH6.8磷酸緩沖液(PBS)6.8PCR通用試劑。6.9無菌去離子水。6.11電泳緩沖液儲存液(5×TBE):稱取54gThis,3.72gNa?EDTAH?O和275g硼酸，溶于800mL的dH?0中，充分攪拌溶解后加水定容至1L,pH8.0,室溫保存。10倍稀釋后使用。7痰樣本的采集、運輸、保存和處理7.1痰樣本的采集、運輸、保存露天開放通風環(huán)境或負壓環(huán)境內，在專業(yè)人員指導下，受檢測人員早晨空腹采集肺深部的痰液5mL,置于50mL無菌離心管中，1h內送達實驗室進行檢測。如果不能及時送達，可以4℃-8℃保存，24h內應送達實驗室檢測。痰液中需要看到干酪樣的瘀塊。痰樣本放置于樣本運輸箱內，運輸至實驗室。7.2痰樣本的液化除菌處理痰樣本的處理需要在生物安全柜內完成。確認頻樣本的數量為5mL,并且其中有不少于3個干酪樣痰塊后，加入2倍體積的4%NaOH和2.9%拘櫞酸鈉的混合溶液(使用時按照0.25g50mL含量加人NALC),緩慢混勻20min后，加入pH6.8的PBS至50mL,充分混勻后，4℃水平離心15min,檢測過程中分別設陽性對照和陰性對照。陽性對照為鳥分枝桿菌標準菌株(ATCC25291):陰性對照用無菌水或非鳥分枝桿菌的細菌核酸作為PCR反應的模板。8.3.4PCR反應體系組成95℃預變性3min;94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,30個循環(huán)；72℃廷伸5min;4℃保溫。因不同PCR儀器的性能差異，可根據條件優(yōu)化適當調整PCR退火溫度和時間。用0.5×TBE電泳緩沖液制備1.8%的瓊脂糖凝膠平板(含溴化乙錠或其他等效染料)。取PCR擴增產物10μL和上樣緩沖液1μL混勻后加入樣品孔。在電泳時設立DNA標準分子量作對照。按100V的電壓條件電泳約1h。采用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察核酸條帶并判斷結果顯微鏡檢查找到染色呈紅色的桿菌時，判斷為“找到抗酸桿菌”。顯微鏡檢查未找到染色呈紅色8.4.2PCR結果判斷當陽性對照出現為91bp核酸條帶，而空白對照沒有任何核酸條帶出現時才可對樣本進行結果判斷及報告，否則視為實驗失敗，需重新實驗本標準檢驗結果判斷如下：——檢測樣本出現為91hop核酸條帶，判斷為“檢出鳥分枝桿菌基因”;——檢測樣本沒有任句核酸條帶出現，判斷為“未檢出鳥分枝桿菌基因”。8.5結果報告本標準檢測報告如下：——檢測細菌培養(yǎng)樣本中