活細(xì)胞分析在免疫學(xué)中的十大應(yīng)用

SR正OZIUS免疫細(xì)胞體外分析的主要方法包括流式細(xì)胞術(shù)、PCR以及各種形式的ELISA（如ELISPOT）。這些技術(shù)加在一起，可以從分子水平上對(duì)不同的細(xì)胞群的功能進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)免疫反應(yīng)進(jìn)行量化，例如，細(xì)胞因子的釋放。雖然這些平臺(tái)非常強(qiáng)大，但近年來，實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析已成為免疫學(xué)研究重要的研究方法，突破了傳統(tǒng)方法的諸多限制。在這里，我們總結(jié)了10個(gè)活細(xì)2活細(xì)胞分析是利用延時(shí)成像（數(shù)小時(shí)至數(shù)周）對(duì)活細(xì)胞的2.在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中將細(xì)胞維持在不受干擾的穩(wěn)定的生理CultureManipulateAssayEndpointflowcytometry)ContinuousCellhealth,morphologyandplateuniformity(e.g.,proliferation,maturatiCultureManipulateAssayEndpointflowcytometry)ContinuousCellhealth,morphologyandplateuniformity(e.g.,proliferation,maturatiSingletimepoint賽多利斯推出專業(yè)的活細(xì)胞分析系統(tǒng)Incucyte?,可以自動(dòng)收集、分析和展示2000多個(gè)平行實(shí)驗(yàn)（如6x384孔微孔不是細(xì)胞板），這樣就可以在不干擾細(xì)胞的情況下捕捉非貼壁細(xì)胞的高質(zhì)量圖像。另外，搭配優(yōu)化的活細(xì)胞試劑、SingletimepointMonitorefectoftreatment(e.g.,diferentiation,drugtreatment)3作用。該方法適用于所有類型的免疫細(xì)胞，包括T細(xì)胞、免疫細(xì)胞可以通過一些不同的方式進(jìn)行非侵入式的活細(xì)胞可以作為細(xì)胞數(shù)量的代表性方法（圖2）。至少達(dá)到80%的匯合度，這個(gè)數(shù)據(jù)指標(biāo)與細(xì)胞直接計(jì)數(shù)法和ATP熒光檢測(cè)的結(jié)果高度一致，證明了此數(shù)據(jù)的可靠性。但是，對(duì)于密集的培養(yǎng)物，或者考察單個(gè)細(xì)胞區(qū)域隨時(shí)間的變化，這種相關(guān)性會(huì)減弱。此外，也可以使用熒光標(biāo)簽，如核靶向熒光蛋白（如Incucyte?NuclightLentivirus）或非干擾染料（如Incucyte?CytolightRapidDye）。細(xì)胞核計(jì)數(shù)能夠?qū)?xì)胞數(shù)量進(jìn)行精準(zhǔn)測(cè)量，即使細(xì)胞被擠在一起，熒光標(biāo)在最近的發(fā)展中，可以使用新的圖像分割工具（Incucyte?和形狀（偏心度）等指標(biāo)在單個(gè)細(xì)胞水平上對(duì)視野中的所有細(xì)胞進(jìn)行計(jì)算，并使用類似于流式細(xì)胞儀中使用的“散并對(duì)細(xì)胞群中單個(gè)細(xì)胞的參數(shù)更深入地了解。無論采用哪種方法，都能產(chǎn)生完整的時(shí)間過程數(shù)據(jù)、洞察有價(jià)值的細(xì)熒光標(biāo)記的CD抗體（Abs）被廣泛用于流式細(xì)胞儀，用于細(xì)胞識(shí)別和免疫分型?；谶@些特征，至少有15種人類T細(xì)胞亞型被描述出來（例如，CD4+，CD8+，等等）?，F(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了使用相同原理的活細(xì)胞分析方法。與其使用直接標(biāo)記的Abs，不如將抗CD的Abs結(jié)合到同型匹配的帶有熒光標(biāo)簽的Fc區(qū)域靶向Fab片段（如Incucyte?），Confluence,24h1005025040K20K0244872965040K20K0244872964在檢測(cè)中使用一種非干擾性的背景熒光抑制染料，以幫助改善488nM的熒光信號(hào)。然后將Fabfluor-488標(biāo)和抑制劑直接加入到細(xì)胞中，只有表達(dá)表面標(biāo)志物的細(xì)胞才會(huì)發(fā)出熒光。然后，細(xì)胞亞群可以很容易地被識(shí)別并隨CD4+、CD8+）的百分比，并將形態(tài)學(xué)屬性與不同的亞群聯(lián)系起來，并且測(cè)量細(xì)胞占比隨時(shí)間的變化。更有用的是能夠觀察培養(yǎng)物中細(xì)胞亞群之間的相互作用--例如，在基于PBMC的免疫細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)中，CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞免疫細(xì)胞的分化和激活是免疫力和免疫應(yīng)答的關(guān)鍵步驟。細(xì)胞通過受體信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行擴(kuò)增并產(chǎn)生功能效應(yīng)，最終導(dǎo)致基因表達(dá)、分化和表型變化?；罴?xì)胞分析很適合研究其復(fù)雜性和動(dòng)態(tài)性。在一個(gè)簡(jiǎn)單的案例中，我們?cè)u(píng)估了化合劑誘導(dǎo)的人類中性粒細(xì)胞的激活（圖3）。圖像分割工具用Fabfluor-488/Ab復(fù)合物進(jìn)行定量）的時(shí)間和濃度依賴性的變化。這些變化的時(shí)間過程相似（0-6小時(shí)），偏心度在進(jìn)一步分析中，我們檢測(cè)了刺激誘導(dǎo)人THP-1單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化。對(duì)照組（未處理）和受刺激的THP-1細(xì)胞中，隨處可見的細(xì)胞表面標(biāo)記物CD45在三天的監(jiān)測(cè)過程中沒有任何的變化。CD45可被認(rèn)為是一個(gè)穩(wěn)定的"管家"蛋白。在控制條件下，THP-1細(xì)胞在長達(dá)72小時(shí)內(nèi)幾0.60.50.4Vehicle0.60.50.4log[CXCL8](M)0.80.60.40.04nMvehicle,02460.80.60.4log[CXCL8](M)圖3:中性粒細(xì)胞激活的量化。將新鮮分離的人中性粒細(xì)胞以40,000/孔接種在涂有Matrigel?（50μg/mL）的96孔板中，并在Fabfluor-488標(biāo)記的5分化劑，如維生素D3、IFNγ+m4）。維生素D3沒有上調(diào)CD40。仔細(xì)觀察細(xì)胞圖像，只有PMA使細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生了明顯的變化，產(chǎn)生了大的、扁平的、粘附的"巨噬細(xì)胞"樣細(xì)胞。只有那些用PMA處理的這些數(shù)據(jù)共同說明了如何使用Incucyte?一種檢測(cè)工具來同時(shí)檢測(cè)表面蛋白標(biāo)志物、細(xì)胞形態(tài)和功能隨時(shí)間的變化，上述應(yīng)用也可以通過使用專為活細(xì)胞分析而優(yōu)化的熒光染料，與細(xì)胞凋亡或細(xì)胞健康讀數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)。例如，細(xì)胞凋亡可以通過磷脂酰絲氨酸外翻（Incucyte?AnnexinV胞非通透性的DNA結(jié)合熒光探針（如Incucyte?CytotoxRedDye）可用于檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性?；罴?xì)胞分析的實(shí)時(shí)讀數(shù)提供了對(duì)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡的時(shí)間過程以及它們與細(xì)胞增殖的關(guān)系的洞察（Artymovich和Appledorn，UndiferentiatedVitaminD3(50nM)ProliferationVitD3Undiff.VitD350250244872log[CXCL8](M)80604020080CD4060402000244872806040200024487200244872VitD3Undiff.log[CXCL8](M)CD14或CD40復(fù)合的情況下暴露于培養(yǎng)基（未分化明顯變化（高清相差圖像）。動(dòng)力圖突出了各種處理?xiàng)l件下不同的、隨時(shí)間變化的表面蛋白表達(dá)。了細(xì)胞增殖（匯合）的減少和吞噬潛力的增加，這是通過用pHrodo?紅細(xì)胞標(biāo)記試劑盒標(biāo)記的凋亡Jurkat6可能不同（例如，釋放細(xì)胞因子、細(xì)胞毒性顆?；騌OS、Fas/FasL相互作用），但最終這些免疫防御者通過細(xì)胞裂監(jiān)測(cè)其紅色熒光的損失。例如，THP-1細(xì)胞被核靶向RFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)移至96孔板上。加入預(yù)激活的PBMCs（抗），的裂解，最終完全失去RFP信號(hào)。細(xì)胞溶解的速度取決于查細(xì)胞圖像得到驗(yàn)證，顯示膜破壞、運(yùn)動(dòng)能力喪失和目標(biāo)細(xì)胞的收縮。類似的檢測(cè)原理可以應(yīng)用于腫瘤球的殺傷。在圖5中，Incucyte?NuclightRedA549腫瘤細(xì)胞在加入PBMCs之前，在超低吸附板（ULA）中形成并生長3天形成3D球細(xì)胞模型。隨著時(shí)間的推移，PBMCs裂解了球狀這種形式可以擴(kuò)展到在第二熒光通道中直接測(cè)量目標(biāo)細(xì)胞的凋亡（McCormack,etal.,2013）。只要效應(yīng)細(xì)胞比目標(biāo)細(xì)胞小，任何來自PBMCs的凋亡信號(hào)都可以通過熒光對(duì)象的尺寸門控來排除。為了說明這一點(diǎn)，CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞與Incucyte?NuclightRedA549細(xì)胞在Incucyte?Caspase3/7染料（5mM）存在下共同培養(yǎng)在96孔板上。在此應(yīng)用案例中，T細(xì)胞殺傷開始大約需要48小時(shí)，同時(shí)），這些方法對(duì)于表征檢查點(diǎn)抑制劑、CAR-T細(xì)胞、雙特異性++Anti-CD3/IL-2(10ngmL)A549+PBMCs30200A549Alone+AntiCD3/IL-2TimeAfterPBMCAddition(h)HD相位和熒光圖像比較了在沒有（非激活，上7微生物（如微生物病原體）和外來的、垂死的細(xì)胞被滅活并從體內(nèi)清除。免疫系統(tǒng)的專業(yè)吞噬細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、Kuppfer細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和未成熟的樹突狀通過檢測(cè)其熒光標(biāo)簽來進(jìn)行。其中非常重要的是要區(qū)分吞噬作用和非特異性的細(xì)胞吸收或表面結(jié)合的非內(nèi)化標(biāo)簽。Incucyte?已經(jīng)開發(fā)了使用pH值敏感染料（如pHrodo?)標(biāo)記活細(xì)胞分析方法，該標(biāo)簽與細(xì)菌壁蛋白或目標(biāo)細(xì)胞連在第一個(gè)例子中，通過加入pHrodo?綠色標(biāo)記的大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的熒光隨著時(shí)間的推移（24小時(shí)）而增加，因?yàn)樯镱w粒被內(nèi)化了（圖6）。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，如果沒有?；蚴褂梅峭淌杉?xì)胞（如A549），則觀察不到熒光（數(shù)據(jù)未顯示）。細(xì)胞吞噬作用的抑制劑，包括細(xì)胞松弛素D和為了說明哺乳動(dòng)物細(xì)胞的吞噬作用（"胞葬作用"），我們描述了抗CD47抗體介導(dǎo)的小鼠骨髓巨噬細(xì)胞對(duì)CD47+CCRF-CEMT淋巴細(xì)胞的吞噬。CD47是一種跨膜是一種有希望的免疫治療新方法?？笴D47抗體（0.04-5），0’30’240’10-3ou10-3oug/wel3pg/welloug/wel2.00.50.00.80.40.00.04ugmL20o o o0.2ugmL0.04ugmL0031030Bioparticle(ug/well)TreatmentGroup值得注意的是，吞噬作用取決于生物顆粒的數(shù)量（B）。使用Incucyte?的pHrodo?紅細(xì)胞標(biāo)記抗CD47的情況下，目標(biāo)細(xì)胞被骨髓來源的巨噬細(xì)胞吞噬，增加了熒光信號(hào)并產(chǎn)生了濃度依賴8這兩種情況下，信號(hào)窗口都很大，而且吞噬可以通過可視化來驗(yàn)證。這種功能驗(yàn)證分析可用于篩選新的CD47調(diào)節(jié)御感染的機(jī)制之一。當(dāng)中性粒細(xì)胞遇到入侵的病原體時(shí)，它們會(huì)釋放出一種抗菌蛋白和染色質(zhì)的混合物來捕獲和降解微生物?；罴?xì)胞分析可以通過使用熒光DNA結(jié)合試劑實(shí)當(dāng)使用NETosis誘導(dǎo)刺激物（如PMA、IO理中性粒細(xì)胞時(shí)，熒光強(qiáng)度迅速上升，細(xì)胞邊界會(huì)顯示降解的DNA云或光暈（圖7）?？梢杂^察到細(xì)胞核的退化和外翻，以及活性氧（ROS）檢測(cè)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，可以闡明個(gè)重要組成部分。中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞都會(huì)以這種方式被吸引到病原體和炎癥刺），檢測(cè)趨化作用。新型的transwell在每個(gè)孔中都有精確的激光鉆孔供細(xì)胞移動(dòng)通過。與傳統(tǒng)的Boydenchamber實(shí)驗(yàn)不同的是，當(dāng)細(xì)胞向化學(xué)試劑移動(dòng)時(shí)，可以對(duì)其進(jìn)行可視化和量化。與早期的應(yīng)用一樣，這種方法能夠更深入地洞與-Boydenchamber實(shí)驗(yàn)相比，所需的細(xì)胞數(shù)量要少得多0d0h0m0d0h32m0d1h2m0d2h2m550.50.03343220002460.013YM0.04YM0.37UM3.33UMnM圖7：NETosis的量化。在Incucyte?Cytotox綠色染料（250nM）和CellROX?DeepRed（5μM，ThermoScienti?處理新鮮分離的人中性粒細(xì)胞。相位和熒光圖像顯示（A）活性氧（ROS，紅色，0-2小時(shí)）的瞬時(shí)產(chǎn)生，細(xì)胞核的解聚（30-60分鐘）和細(xì)胞外DNA9在體外測(cè)量病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的感染性和復(fù)制能力對(duì)免疫細(xì)胞佐劑至關(guān)重要。與傳統(tǒng)的蝕斑實(shí)驗(yàn)和病灶形成實(shí)驗(yàn)相比，活細(xì)胞分析可以通過計(jì)算被熒光蛋白（如GFP）標(biāo)記的病毒的細(xì)胞數(shù)量和程度來自動(dòng)量化病毒的傳播和復(fù)這種方法已在一系列病毒研究中被使用并發(fā)表，包括），也可以檢測(cè)細(xì)胞的凋亡或壞死程度。Incucyte?活細(xì)胞分析工作流程的一個(gè)有趣的優(yōu)點(diǎn)是，當(dāng)添加病毒或病毒復(fù)制體到細(xì)胞后，培養(yǎng)板不需要離開培養(yǎng)箱。因此，即使是高度傳染性的病毒也可以在適當(dāng)?shù)纳锔綦x設(shè)施中安全地進(jìn)行單克隆抗體（mAb）和抗體偶聯(lián)藥物（ADCs）被廣泛用于這些生物制劑的一個(gè)關(guān)鍵特性是內(nèi)化到不同細(xì)胞中的程度活細(xì)胞分析可以在96孔板中檢測(cè)Ab內(nèi)化。使用對(duì)pH值敏感的熒光染料檢測(cè)Ab進(jìn)入酸性溶菌酶的內(nèi)化，其思路與?Fabfluor-pH染料）實(shí)現(xiàn)的，只需一步，無需洗滌，提供高效、高通量的樣品制備。為了證明這一點(diǎn)，用