酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定ELISA檢測(cè)技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定ELISA檢測(cè)技術(shù)

1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzymelinked

immunosorbentassay,ELISA)用于IgG定量測(cè)定的文章，使得1966年開始用于抗

原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測(cè)定方法。這一方法的基本原

理是：①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或

抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又

保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗

體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上

形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受

檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)

物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量

分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到

很高的敏感度。

ELISA的原理ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固

相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫

學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)與固相

載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物

與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相

載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底

物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故

可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免

疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。

ELISA的類型ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)

必要的試劑：(1)固相的抗菌素原或抗體，即"免疫吸附劑"(immunosorbent)；(2)

酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"(conjugate)；(3)酶反應(yīng)的底物。根據(jù)試劑的

來(lái)源和標(biāo)本的情況以及檢測(cè)的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。用于

臨床檢驗(yàn)的ELISA主要有以下幾種類型：

2.2.1雙抗體夾心法測(cè)抗原雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，操作步驟如下:

1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

2）加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)

合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。3）加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上

的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量

與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。

通過(guò)比色，測(cè)知標(biāo)本中抗原的量。在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大

分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗

體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。如抗體的來(lái)源為抗血清，

包被和酶標(biāo)用的抗體最好分別取自不同種屬的動(dòng)物。如應(yīng)用單克隆抗體，一般選擇

兩個(gè)針對(duì)抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。這種

雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng)，

作一步檢測(cè)。在一步法測(cè)定中，當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí)，過(guò)量抗原分別和

固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成”夾心復(fù)合物”。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩

的后帶現(xiàn)象，此時(shí)反應(yīng)后顯色的吸光值（位于抗原過(guò)剩帶上）與標(biāo)準(zhǔn)曲線（位于抗

體過(guò)剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同（參見132,圖1-4）,如按常法測(cè)讀，所

得結(jié)果將低于實(shí)際的含量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)（hookeffect）,因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線

到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)，反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

因此在使用一步法試劑測(cè)定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg、AFP

和尿液hCG等）時(shí)，應(yīng)注意可測(cè)范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類

試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。假使在被測(cè)分子的不同位點(diǎn)上含有多個(gè)相同的決定簇，例如

HBsAg的a決定簇,也可用針對(duì)此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物。

但在HBsAg的檢測(cè)中應(yīng)注意亞型問(wèn)題，HBsAg有adr>adw、ayr>ayw4個(gè)亞型，

雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應(yīng)性，這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問(wèn)題。

雙抗體夾心法測(cè)抗原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗

體，多為IgM型，能和多種動(dòng)物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測(cè)的血清

標(biāo)本中如含有RF,它可充當(dāng)抗原成份，同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假

陽(yáng)性反應(yīng)。采用F（abD或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑，由于去除了Fc段，從而消

除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的

一項(xiàng)考核指標(biāo)（參見6.2）。雙抗體夾心法適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，

但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。

2.2.2雙抗原夾心法測(cè)抗體反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和

制備酶結(jié)合物，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替

酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于

間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備,

應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。

2.2.3間接法測(cè)抗體間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗

人免疫球蛋白抗體）以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法（見圖2-3）。

操作步驟如下：1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合

的抗原及雜質(zhì)。2）加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)

合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中

的其他成份在洗滌過(guò)程中被洗去。3）加酶標(biāo)抗抗體?？捎妹笜?biāo)抗人Ig以檢測(cè)總抗

體，但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測(cè)IgG抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體

抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的

量正相關(guān)。4）加底物顯色本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷。

間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方

法。間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時(shí)用粗提抗原包被也能取得實(shí)際有

效的結(jié)果，但應(yīng)盡可能予以純化，以提高試驗(yàn)的特異性。特別應(yīng)注意除去能與一般

健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì)，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli

成份，很可能與受過(guò)E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應(yīng)?？乖幸膊荒?/p>

含有與酶標(biāo)抗人坨反應(yīng)的物質(zhì)，例如來(lái)自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的

Ig去除，試驗(yàn)中也發(fā)生假陽(yáng)性反應(yīng)。另外如抗原中含有無(wú)關(guān)蛋白，也會(huì)因競(jìng)爭(zhēng)吸附

而影響包被效果。間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。

病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強(qiáng)，非特

異IgG可直接吸附到固相載體上，有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法

中，抗原包被后一般用無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）

固相上的空余間隙。另外，在檢測(cè)過(guò)程中標(biāo)本須先行稀釋（1:40~1:200）,以避免過(guò)

高的陰性本底影響結(jié)果的判斷。

2.2.4競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗

原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)

與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽(yáng)性反

應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會(huì)有干擾物

質(zhì)，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體，然

后加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質(zhì)，然后再加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體進(jìn)

行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)。競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體有多種模式，可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競(jìng)爭(zhēng)

結(jié)合，抗HBcELISA一般采用此法。另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗

體中進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)抗體，與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)?？笻Be

的檢測(cè)一般采用此法。

2.2.5競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此

不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一

定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶

標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。

226捕獲包被法測(cè)抗體IgM抗體的檢測(cè)用于傳染病的早期診斷中。間接法ELISA

一般僅適用于檢測(cè)總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測(cè)定IgM抗體,

因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體，后者將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗原而使一部份

IgM抗體不能結(jié)合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測(cè)定IgM抗體，必

須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。在臨床檢驗(yàn)中測(cè)定抗

體IgM時(shí)多采用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM

(其中包括針對(duì)抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM)。然后加入抗原，此抗

原僅與特異性IgM相結(jié)合。繼而加酶標(biāo)記針對(duì)抗原的特異性抗體。再與底物作用，

呈色即與標(biāo)本中的IgM成正相關(guān)。此法常用于病毒性感染的早期診斷。甲型肝炎病

毒(HAV)抗體的檢測(cè)模式見圖2-7o類風(fēng)濕因子(RF)同樣能干擾捕獲包被法測(cè)

定IgM抗體，導(dǎo)致假陽(yáng)性反應(yīng)。因此中和IgG的間接法近來(lái)頗受青睞，用這類試劑

檢測(cè)抗CMVIgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。

2.2.7ABS-ELISA法ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(tǒng)(system)的略語(yǔ)。親和素是

一種糖蛋白，分子量60000,每個(gè)分子由4個(gè)能和生物素結(jié)合的亞基組成。生物素

為小分子化合物，分子量244。用化學(xué)方法制成的衍生物素-羥基琥珀酰亞胺酯可與

蛋白質(zhì)和糖等多種類型的大小分子形成生物素標(biāo)記產(chǎn)物，標(biāo)記方法頗為簡(jiǎn)便。生物

素與親和素的結(jié)合具有很強(qiáng)的特異性，其親和力較抗原抗體反應(yīng)大得多，兩者一經(jīng)

結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于一個(gè)親和素可與4個(gè)生物素分子結(jié)合，因此如把ABS與ELISA

法可分為酶標(biāo)記親和素-生物素(LAB)法和橋聯(lián)親和素-生物素(ABC)法兩種類

型。兩者均以生物素標(biāo)記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統(tǒng)中的酶標(biāo)抗體（抗原）。

在LAB中，固相生物素先與不標(biāo)記的親和素反應(yīng)，然后再加酶標(biāo)記的生物素以進(jìn)一

步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為堿性糖蛋白，與聚

苯乙烯載體的吸附性很強(qiáng)，用于ELISA中可使本底增高。從鏈霉菌中提取的鏈霉親

和素則無(wú)此缺點(diǎn)，在ELISA應(yīng)用中有替代前者的趨勢(shì)。由于ABS-ELISA較普通

ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗(yàn)中ABS-ELISA應(yīng)用不多

方法類型和操作步驟

ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：

①固相的抗原或抗體，②酶標(biāo)記的抗原或抗體，③酶作用的底物。根據(jù)試劑的來(lái)源

和標(biāo)本的性狀以及檢測(cè)的具備條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。

（一）雙抗體夾心法雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，操作步驟如下：1）

將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。2）

加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的

抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。3）加酶標(biāo)抗體：使

固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相

載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。4）加底物：夾心式復(fù)合物中的酶

催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。根據(jù)同樣

原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物，即可用雙抗原夾心法測(cè)

定標(biāo)本中的抗體。

（二）雙位點(diǎn)一步法

在雙抗體夾心法測(cè)定抗原時(shí)，如應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗

體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測(cè)定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩

步并作一步（圖15-5）。這種雙位點(diǎn)一步不但簡(jiǎn)化了操作，縮短了反應(yīng)時(shí)間，如應(yīng)

用高親和力的單克隆抗體，測(cè)定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用

使測(cè)定抗原的ELISA提高到新水平。

在一步法測(cè)定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)（hookeffect）,類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶

現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測(cè)抗原濃度相當(dāng)高時(shí)，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，

而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假

陰性結(jié)果。

（三）間接法測(cè)抗體

間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合

的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：

（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。

（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。

經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不

能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過(guò)程中被洗去。

（3）加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶。

洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測(cè)人對(duì)某種疾病的抗體，

可用酶標(biāo)羊抗人IgG抗體。

（4）加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。

本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體。

（四）競(jìng)爭(zhēng)法

競(jìng)爭(zhēng)法可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原

競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作

步驟如下：

（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。

（2）待測(cè)管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)。如

受檢標(biāo)本中無(wú)抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原，

則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會(huì)與固相抗體結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體

結(jié)合的機(jī)會(huì)，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標(biāo)抗原，保溫

后，酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)最充分的量。洗滌。（3）加底物顯色：參考

管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測(cè)管顏色深度之

差，代表受檢標(biāo)本抗原的量。待測(cè)管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多。

（五）捕獲法測(cè)IgM抗體

血清中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在，后者會(huì)干擾IgM抗體

的測(cè)定。因此測(cè)定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特

異性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再測(cè)定特異性IgM。操作步驟如下：

（1）將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。

（2）加入稀釋的血清標(biāo)本：保溫反應(yīng)后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除

去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。

（3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合。洗滌。

（4）加入針對(duì)特異性的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合。洗滌。

（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標(biāo)本中的特異性IgM抗體存在，是為

陽(yáng)性反應(yīng)。

（六）應(yīng)用親和素和生物素的ELISA

親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD,每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成，

可以和4個(gè)生物素分子親密結(jié)合?，F(xiàn)在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉和素

（strepavidin）o生物素（biotin）又稱維生素H,分子量244.31,存在于蛋黃中。用

化學(xué)方法制成的衍生物，生物素一羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide,BNHS）

可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素與生物

素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。

由于1個(gè)親和素分子有4個(gè)生物素分子的結(jié)合位置，可以連接更多的生物素化的分

子，形成一種類似晶格的復(fù)合體。因此把親和素和生物素與ELIS偶聯(lián)起來(lái)，就可

大提高ELISA的敏感度。

親和素一生物素系統(tǒng)在ELISA中的應(yīng)用有多種形式，可用于間接包被，亦可用于終反

應(yīng)放大?？梢栽诠滔嗌舷阮A(yù)包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物

素結(jié)合，通過(guò)親和素一生物素反應(yīng)而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不

僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結(jié)合點(diǎn)充分暴露。另外，在常規(guī)ELISA中

的酶標(biāo)抗體也可用生物素化的抗體替代，然后連接親和素一酶結(jié)合物，以放大反應(yīng)

信號(hào)。

ELISA普遍用作非放射性同位素的成鍵化驗(yàn).在這種方法中，通常標(biāo)準(zhǔn)配體是固定的,

通過(guò)加入溶液相受體或蛋白質(zhì)來(lái)使之成鍵.通過(guò)加入與受體特異性反應(yīng)的抗體來(lái)定

量成鍵的受體，而且最初抗體的量以加入第二種能顯色的抗體測(cè)量.第二種抗體能

識(shí)別抗體的末端，在其末端的堿性磷酸酯或過(guò)氧化物酶等與酶發(fā)生反應(yīng)，從而使溶

液顯色.

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）

1.ELISA的原理ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)

合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留

其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）

與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體

復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合

在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反

應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相

關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放

大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。

2.ELISA的類型ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中

有三個(gè)必要的試劑：(1)固相的抗菌素原或抗體，即"免疫吸附齊廣(immunosorbent)；

(2)酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為“結(jié)合物"(conjugate)；(3)酶反應(yīng)的底物。根據(jù)

試劑的來(lái)源和標(biāo)本的情況以及檢測(cè)的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。

用于臨床檢驗(yàn)的ELISA主要有以下幾種類型：

2.2.1雙抗體夾心法測(cè)抗原

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雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，操作步驟如下：1)將特異性抗體與固相

載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。2)加受檢標(biāo)本，保溫反

應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未

結(jié)合物質(zhì)。3)加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。

徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相

關(guān)。4)加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過(guò)比色，測(cè)知標(biāo)本中抗

原的量。

在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、

AFP、hCG等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備

酶結(jié)合物而建立此法。如抗體的來(lái)源為抗血清，包被和酶標(biāo)用的抗體最好分別取自

不同種屬的動(dòng)物。如應(yīng)用單克隆抗體，一般選擇兩個(gè)針對(duì)抗原上不同決定簇的單抗，

分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性，而

且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng)，作一步檢測(cè)。在一步法測(cè)定中，當(dāng)

標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí)，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再

形成"夾心復(fù)合物"。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶現(xiàn)象，此時(shí)反應(yīng)后顯色的吸

光值（位于抗原過(guò)剩帶上）與標(biāo)準(zhǔn)曲線（位于抗體過(guò)剩帶上）某一抗原濃度的吸光

值相同，如按常法測(cè)讀，所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)

（hookeffect）,因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)，反應(yīng)甚至

可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測(cè)定標(biāo)本中含量可異常增高的

物質(zhì)（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時(shí)，應(yīng)注意可測(cè)范圍的最高值。

用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。

假使在被測(cè)分子的不同位點(diǎn)上含有多個(gè)相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，

也可用針對(duì)此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物。但在HBsAg的檢測(cè)中

應(yīng)注意亞型問(wèn)題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個(gè)亞型，雖然每種亞型均有相同

的a決定簇的反應(yīng)性，這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問(wèn)題。雙抗體夾心法測(cè)抗

原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，

能和多種動(dòng)物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測(cè)的血清標(biāo)本中如含有RF,

它可充當(dāng)抗原成份，同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽(yáng)性反應(yīng)。采用F

（ab）或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑，由于去除了Fc段，從而消除RF的干擾。雙

抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項(xiàng)考核指標(biāo)（參

見6.2）。

雙抗體夾心法適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測(cè)定半抗原及

小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。

2.2.2雙抗原夾心法測(cè)抗體反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被

和制備酶結(jié)合物，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代

替酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高

于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，

應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。

2.2.3間接法測(cè)抗體

間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗

體）以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：1）將特異

性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。2）加稀釋

的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)

合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過(guò)程中

被洗去。3）加酶標(biāo)抗抗體。可用酶標(biāo)抗人Ig以檢測(cè)總抗體，但一般多用酶標(biāo)抗人

IgG檢測(cè)IgG抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)

記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。4）加底物顯色

本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換

包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。

間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時(shí)用粗提抗原包被也能取得實(shí)際有效的

結(jié)果，但應(yīng)盡可能予以純化，以提高試驗(yàn)的特異性。特別應(yīng)注意除去能與一般健康

人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì)，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成

份，很可能與受過(guò)E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應(yīng)?？乖幸膊荒芎?/p>

有與酶標(biāo)抗人Ig反應(yīng)的物質(zhì)，例如來(lái)自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig

去除，試驗(yàn)中也發(fā)生假陽(yáng)性反應(yīng)。另外如抗原中含有無(wú)關(guān)蛋白，也會(huì)因競(jìng)爭(zhēng)吸附而

影響包被效果。

間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢

的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強(qiáng)，非特異IgG可直接吸

附到固相載體上，有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被后

一般用無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空

余間隙。另外，在檢測(cè)過(guò)程中標(biāo)本須先行稀釋（1:40~1:200）,以避免過(guò)高的陰性本

底影響結(jié)果的判斷。

2.2.4競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體

:「一

蘇/霞1▼裁鉤

-L_T—

當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)

特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。標(biāo)

本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽(yáng)性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。

如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會(huì)有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功，

可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體，然后加入抗原，形成固相抗

原。洗滌除去抗原中的雜質(zhì)，然后再加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)。競(jìng)爭(zhēng)法

測(cè)抗體有多種模式，可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，抗HBcELISA

一般采用此法。另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，

洗滌后再加入酶標(biāo)抗體，與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)?？笻Be的檢測(cè)一般采用此法。

2.2.5競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因

此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和

一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的

酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。

2.2.6捕獲包被法測(cè)抗體

IgM抗體的檢測(cè)用于傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用于檢測(cè)總抗

體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測(cè)定IgM抗體，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在

較高濃度的IgG抗體，后者將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結(jié)合到固

相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測(cè)定IgM抗體，必須先將標(biāo)本用A蛋白

或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。在臨床檢驗(yàn)中測(cè)定抗體IgM時(shí)多采用捕獲

包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對(duì)抗

原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然后加入抗原，此抗原僅與特異性IgM

相結(jié)合。繼而加酶標(biāo)記針對(duì)抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標(biāo)本中的

IgM成正相關(guān)。此法常用于病毒性感染的早期診斷。甲型肝炎病毒（HAV）抗體的

檢測(cè)模式見圖。類風(fēng)濕因子（RF）同樣能干擾捕獲包被法測(cè)定IgM抗體，導(dǎo)致

假陽(yáng)性反應(yīng)。因此中和IgG的間接法近來(lái)頗受青睞，用這類試劑檢測(cè)抗CMVIgGM

和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。

2.2.7ABS-ELISA法ABS為親和素（avidin）生物素（biotin）系統(tǒng)（system）的略語(yǔ)。親和

素是一種糖蛋白，分子量60000,每個(gè)分子由4個(gè)能和生物素結(jié)合的亞基組成。生

物素為小分子化合物，分子量244。用化學(xué)方法制成的衍生物素-羥基琥珀酰亞胺酯

可與蛋白質(zhì)和糖等多種類型的大小分子形成生物素標(biāo)記產(chǎn)物，標(biāo)記方法頗為簡(jiǎn)便。

生物素與親和素的結(jié)合具有很強(qiáng)的特異性，其親和力較抗原抗體反應(yīng)大得多，兩者

一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于一個(gè)親和素可與4個(gè)生物素分子結(jié)合，因此如把ABS

與ELISA法可分為酶標(biāo)記親和素-生物素（LAB）法和橋聯(lián)親和素-生物素（ABC）

法兩種類型。兩者均以生物素標(biāo)記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統(tǒng)中的酶標(biāo)抗

體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標(biāo)記的親和素反應(yīng)，然后再加酶標(biāo)記的

生物素以進(jìn)一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為堿性

糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強(qiáng)，用于ELISA中可使本底增高。從鏈霉菌中

提取的鏈霉親和素則無(wú)此缺點(diǎn)，在ELISA應(yīng)用中有替代前者的趨勢(shì)。由于

ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗(yàn)中

ABS-ELISA應(yīng)用不多。

在臨床檢驗(yàn)中一般采用商品試劑盒進(jìn)行測(cè)定。前文（2.2）已述，ELISA中有三個(gè)

必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。完整的ELISA試劑盒包含以下

各組分：（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗

體（結(jié)合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品（定性測(cè)定中），參考

標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測(cè)定中）；（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）

酶反應(yīng)終止液。

3.1免疫吸附劑已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2~8℃）干燥的條件下一般

可保存6個(gè)月。有些不完整的試盒，僅供應(yīng)包被用抗原或抗體，檢測(cè)人員需自行包

被。以下簡(jiǎn)述固相載體和包被過(guò)程。

3.1.1固相載體固相載體在ELISA測(cè)定過(guò)程中作為吸附劑和容器,不參與化學(xué)反應(yīng)。

可作ELISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋

白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性，加之它的價(jià)

格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。ELISA載體的形

狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA

的產(chǎn)品稱為ELISA板，國(guó)際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為8x12的96孔式。為便于作少量

標(biāo)本的檢測(cè)，有制成8聯(lián)孔條或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板

相同。ELISA板的特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測(cè)，并可在特制的比色計(jì)上迅

速讀出結(jié)果?，F(xiàn)在已有多種自動(dòng)化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測(cè)，包括加樣、

洗滌、保溫、比色等步驟，對(duì)操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，其

吸附性能特別是對(duì)免疫球蛋白的吸附性能增加，應(yīng)用于雙抗體夾心法可使固相上抗

體量增多，但用于間接法測(cè)抗體時(shí)空白值較大。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性

能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性

能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差

異很大，因此，每一批號(hào)的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。常用的檢查方法

為：以一定濃度的人IgG（一般為lOng/ml）包被ELISA板各孔，洗滌后每孔內(nèi)加

入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后，分

別測(cè)每孔溶液的吸光度?？刂品磻?yīng)條件，使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計(jì)算全部

讀數(shù)的平均值。所有單個(gè)讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù)之差，應(yīng)小于10%。與聚苯乙烯

類似的塑料是聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯的特點(diǎn)為質(zhì)軟板薄，可剪

害U，價(jià)廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對(duì)蛋白

質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。為比較不同固相在某一ELISA

測(cè)定中的優(yōu)劣，可應(yīng)用如下的試驗(yàn)：用其他免疫學(xué)測(cè)定方法選出一個(gè)典型的陽(yáng)性標(biāo)

本和陰性標(biāo)本，將它們進(jìn)行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操

作步驟進(jìn)行測(cè)定，然后比較結(jié)果。在哪一種載體上陽(yáng)性結(jié)果與陰性結(jié)果差別最大，

這種載體就是這一ELISA測(cè)定項(xiàng)目的最合適的固相載體。在ELISA中，用作固

相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大大增加。

ELISA板孔的吸附面積約為200mm2,小珠均為1000mm2,將近ELISA板孔的5

倍。吸附面積的增大即意味著固相抗原或抗體量的增加。再者，球型小珠的表面弧

度更有利于吸附的抗原決定簇或抗體結(jié)合位點(diǎn)的暴露面處于最佳反應(yīng)狀態(tài)，因此珠

式ELISA的反應(yīng)往往更為靈敏。小珠的另一特點(diǎn)是更易于使洗滌徹底，使用特殊的

洗滌器，使小珠在洗滌過(guò)程中滾動(dòng)淋洗，其洗滌效果遠(yuǎn)較板孔的浸泡式為好。但由

于磨砂工藝的難度較大，小珠的均一性較差。小試管作為固相載體也有較大的吸

附表面，而且標(biāo)本的反應(yīng)量也相應(yīng)增加。板式及珠式ELISA的標(biāo)本量一般為

100-200U1,而小試管可根據(jù)需要加大反應(yīng)體積，標(biāo)本反應(yīng)量的增加有助于試驗(yàn)敏感

性的提高。小試管還可以當(dāng)作比色杯，最后直接放入分光光度計(jì)中比色。也有應(yīng)

用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成的微粒作為ELISA固相載體的。其優(yōu)點(diǎn)是表面積極

大，反應(yīng)在懸液中進(jìn)行，其速率與液相反應(yīng)近似。以含鐵的磁性微粒作為ELISA固

相載體，反應(yīng)后用磁鐵的吸引進(jìn)行分離，洗滌方便，試劑盒一般均配以特殊儀器。

3.1.2包被的方式將抗原或抗體固定在過(guò)程稱為包被（coating）。換言之，包被即是

抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過(guò)程。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸

附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作

用于。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。

載體對(duì)不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有

更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。IgG對(duì)聚苯乙烯等固相具有較強(qiáng)的

吸附力，其聯(lián)結(jié)多發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外，因此抗體的包被一般均采

用直接吸附法。蛋白質(zhì)抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。當(dāng)抗原決定簇存

在于或鄰近于疏水區(qū)域時(shí)，抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴

露，在這種情況下，直接包被效果不佳，可以采用間接的捕獲包被法，即先將針對(duì)

該抗原的特異抗體作預(yù)包被，其后通過(guò)抗原抗體反應(yīng)使抗原固相化。此間接結(jié)合在

固相上的抗原遠(yuǎn)離載體表面，其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經(jīng)固

相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗

原也可采用捕獲包被法（見2.2.4）,試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)

性亦佳。間接包被的另一優(yōu)點(diǎn)是抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。不

易吸附在聚苯乙烯載體上的非蛋白質(zhì)抗原可采用特殊的包被方式。例如，在檢測(cè)抗

DNA抗體時(shí)，需用DNA作為包被抗原，而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結(jié)

合?？蓪⒕郾揭蚁┌逑冉?jīng)紫外線照射（例如30W紫外燈，75cm照射12小時(shí)），以

增加其吸附性能。固相載體先用堿性蛋白質(zhì)，如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預(yù)包被，

也可提高核酸的結(jié)合力。也可用親和素生物素系統(tǒng)作間接包被，即用親和素先包被

載體，然后加入生物素化的DNA,這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗

原物質(zhì)的定量測(cè)定。脂類物質(zhì)無(wú)法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙

醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓

脂質(zhì)自然干固在固相表面?？剐牧字贵w的ELISA試劑一般采用這種包被方式。

3.1.3包被用抗原用于包被固相載體的抗原按其來(lái)源不同可分為天然抗原、重組

抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原可取自動(dòng)物組織、微生物培養(yǎng)物等，須經(jīng)提

取純化才能作包被用。如HBsAg可以從攜帶者的血清中提取，一般的細(xì)菌和病毒抗

原可以從其培養(yǎng)物中提取，蛋白成份抗原可從富含此抗原的材料中提取等（例如AFP

從臍帶血或胎肝中提?。?。重組抗原是抗原基因在質(zhì)粒體中表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以

大腸桿菌或酵母菌為質(zhì)粒體。重組抗原的優(yōu)點(diǎn)是除工程菌成份外，其他雜質(zhì)少，而

且無(wú)傳染性，但純化技術(shù)難度較大。以大腸桿菌為質(zhì)粒體的重組抗原如不能充分除

大腸桿菌成份，用于ELISA,在反應(yīng)中可出現(xiàn)假陽(yáng)性，因不少受檢者受大腸桿菌感

染而在血清中存在抗大腸桿菌抗體。重組抗原的另一特點(diǎn)是能用基因工程制備某些

無(wú)法從天然材料中分離的抗原物質(zhì)。例如丙型肝炎病毒（HCV）尚不能培養(yǎng)成功，

而且丙肝病人血清中HCV抗原含量極微。目前檢測(cè)抗HCVELISA中所用包被抗

原大多為根據(jù)HCV的基因克隆表達(dá)而制備的重組抗原。在傳染病診斷中，不少重

組抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得應(yīng)用。合成多肽抗原是

根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗

原一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難

于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其與無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白

質(zhì)（BSA）等偶聯(lián)，借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。

應(yīng)用多肽抗原的另一注意點(diǎn)為他僅能檢測(cè)與其相應(yīng)的抗體。一種蛋白質(zhì)抗原往往含

有多個(gè)不同的能引起抗體產(chǎn)生的決定簇，因此在受檢血清中的其他抗體就不能與該

多肽抗原發(fā)生反應(yīng)。另外，某些微生物發(fā)生變異時(shí)往往發(fā)生抗原結(jié)構(gòu)變化，在這種

情況下，用個(gè)別多肽抗原進(jìn)行包被可引起其他抗體的漏檢。

3.1.4包被用抗體包被固相載體的抗體應(yīng)具有高親和力和高特異性，可取材于抗血

清或含單克隆抗體的腹水或培養(yǎng)液。如免疫用抗原中含有雜質(zhì)（即便是極微量的），

在抗血清中將出現(xiàn)雜抗體，必須除去（可用吸收法）后才能用于ELISA,以保證試

驗(yàn)的特異性?？寡宀荒苤苯佑糜诎唬瑧?yīng)先提取IgG,通常采用硫酸鏤鹽析和

Sephadex凝膠過(guò)濾法。一般經(jīng)硫酸鏤鹽析粗提的IgG已可用于包被，高度純化的IgG

性質(zhì)不穩(wěn)定。如需用高親和力的抗體包被以提高試驗(yàn)的敏感性，則可采用親和層析

法以除去抗血清中含量較多的非特異性IgGo腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較

強(qiáng)，因此不需要作吸收和親和層析處理，一般可將腹水作適當(dāng)稀釋后直接包被，必

要時(shí)也可用純化的IgG。應(yīng)用單抗包被時(shí)應(yīng)注意，一種單抗僅針對(duì)一種抗原決定簇，

在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。

3.1.5包被的條件包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時(shí)間，包被液的pH等

應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)的特點(diǎn)和材料的性質(zhì)而選定?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸

鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液

作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過(guò)夜，37℃

中保溫2小時(shí)被認(rèn)為具有同等的包被效果。包被的最適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性

質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)

的包被濃度為100ng/ml-20ug/mlo

3.1.6封閉封閉（blocking）是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。

抗原或抗體包被時(shí)所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封

閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾

物質(zhì)的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似。最常用的封閉劑是0。5%-0.5%的牛血清

白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好

的封閉劑，其最大的特點(diǎn)是價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）o高質(zhì)量的速溶食用低脂

奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易長(zhǎng)

期保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。

封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條件。并非所有的ELISA固

相均需封閉，封閉不當(dāng)反而會(huì)使陰性本底增高。一般說(shuō)來(lái)，雙抗體夾心法，只要酶

標(biāo)記物是高活性的，操作時(shí)洗滌徹底，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。特別是用單

抗腹水直接包被時(shí)，因其中大量非抗體蛋白在包被時(shí)同樣也吸附在固相表面，業(yè)已

起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測(cè)定中，封閉一般是不可少的（見2.2.2）。

包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數(shù)月。

3.2結(jié)合物結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原），是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好

的結(jié)合物應(yīng)該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結(jié)合

物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤?，在結(jié)合試劑中應(yīng)盡量不含有或少

含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外，結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)

定性。

3.2.1酶用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性

強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來(lái)源豐富，價(jià)格不貴，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分

和催化能力。最好在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。另外，它的相應(yīng)底物易于制備和

保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。在ELISA中，常用的酶為辣根過(guò)氧化

物酶（horseradishperoxidase,HRP）和堿性磷酸酶（alkalinephosohatase,AP）O在少

數(shù)商品ELISA試劑中，應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化酶、P-D-半乳糖甘酶和服酶等。國(guó)

產(chǎn)ELISA試劑一般都用HRP制備結(jié)合物。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%,

分子量為44000,是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而

成，是一種葉咻蛋白質(zhì)。主酶無(wú)色糖蛋白在275nm波長(zhǎng)處有最高吸收峰，輔基是深

棕色的含鐵嚇啾環(huán)，在403nm波長(zhǎng)處有最高吸收峰。HRP的純度用RZ（ReinheitZahl,

德文，意為純度數(shù)）表示，是403nm的吸光度與280nm吸光度之比，高純度的HRP

的R空?.0。HRP除符合上述的ELISA中標(biāo)記酶的要求外，更有價(jià)格低廉和性質(zhì)

較穩(wěn)定的特點(diǎn)。值得注意的是，在選用酶制劑時(shí)，除其純度RZ外，更應(yīng)注意酶的

活力。高純度的酶如保存不當(dāng)，活力也會(huì)降低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位

表示，可用對(duì)底物作用后生成產(chǎn)物量的測(cè)定進(jìn)行試驗(yàn)。國(guó)外很多ELISA試劑采

用堿性磷酸酶（AP）作為標(biāo)記酶。常用的AP有兩個(gè)來(lái)源，分別從大腸桿菌和小牛

腸膜中提取。不同來(lái)源的酶生化特性特性略不相同，從大腸桿菌中提取的AP分子

量為80000,酶作用的最適合pH為8.0；用小牛腸膜中提取的AP分子量為100000,

最適pH為9.6。在ELISA中,AP系統(tǒng)的敏感度一般高于HRP系統(tǒng)，空白值也較低，

但AP價(jià)格昂貴，制備結(jié)合物所得率也較HRP低。

3.2.2抗原和抗體制備結(jié)合物時(shí)所用抗體一般均為純度較高的IgG,以免在與酶

聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干擾。最好用親和層析純的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特

異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。如用F（ab）2進(jìn)行標(biāo)

記，則更可避免標(biāo)本中RF的干擾。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求

是抗原必須是高純度的。

3.2.3結(jié)合物的制備酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸

鹽氧化法。（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，它可以使酶與蛋

白質(zhì)的氨基通過(guò)它而聯(lián)結(jié)。堿性磷酸一般用此法進(jìn)行標(biāo)記。交聯(lián)方法一步法、兩步

法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗

體。ELISA中常用的酶一般都用此法交聯(lián)。它具有操作簡(jiǎn)便、有效（結(jié)合率達(dá)

60%-70%）和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，酶與抗體交聯(lián)時(shí)分子間

的比例不嚴(yán)格，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，

影響效果。在兩步法中，先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與抗

體作用而形成酶標(biāo)抗體。也可先將抗體與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結(jié)。兩步法的產(chǎn)物

中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的，較一步法的酶結(jié)合物更有助于本

底的改善以提高敏感度，但其偶聯(lián)的有效率較一步法低。

（2）過(guò)碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過(guò)氧化物酶的標(biāo)記常

用此法。反應(yīng)時(shí)，過(guò)碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)

上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合。酶標(biāo)記物按克分子比例聯(lián)結(jié)，其最佳比例為：酶/

抗體=1-2/1。此法簡(jiǎn)便有效，一般認(rèn)為是HRP最可取的標(biāo)記方法，但也有人認(rèn)為所

有試劑較為強(qiáng)烈，各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重演。按以上方法制備的酶結(jié)合物一般都

混有未結(jié)合物的酶和抗體。理論上，結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最

后的酶活性測(cè)定，因經(jīng)過(guò)徹底洗滌，游離酶可被除去，并不影響最終的顯色。但游

離的抗體則不同，它會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，從而減少了結(jié)合到固相上

的酶標(biāo)抗體的量。因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化,去除游離的酶和抗體后用于檢測(cè)，

效果更好。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應(yīng)用。硫酸鐵鹽析法最

為簡(jiǎn)便，但效果并不理想，因?yàn)榇朔ㄖ荒苋コ粼谏锨逯械挠坞x酶，但相當(dāng)數(shù)量的

游離抗體仍與酶結(jié)合物一起沉淀而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更為可

取，高效液相層析法可將制備的結(jié)合物清晰地分成三個(gè)部分：游離酶、游離抗體和

純結(jié)合物而取得最佳的分離效果，但費(fèi)用較貴。

結(jié)合物制得后，在用作ELISA試劑前尚需確定其適當(dāng)?shù)墓ぷ鳚舛?。使用過(guò)濃的結(jié)

合物，既不經(jīng)濟(jì)，又可使本底增高；結(jié)合物的濃度過(guò)低，則又影響檢測(cè)的敏感性。

所以必須對(duì)結(jié)合物的濃度予以選擇。最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度

時(shí)，能維護(hù)一個(gè)低的本底，并獲得測(cè)定的最佳靈敏度，達(dá)到最合適的測(cè)定條件和測(cè)

定費(fèi)用的節(jié)省。就酶標(biāo)抗體本身而言，它的有效工作濃度是指與其相應(yīng)抗原包被的

載體作試驗(yàn)時(shí)，能得到陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度。例如某一HRP：抗人IgG制劑標(biāo)明

的工作濃度為1:5000,表示該制劑經(jīng)1:5000稀釋后，在與人IgG包被的固相作ELISA

試驗(yàn)時(shí)，將發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)。但在用于具體的ELISA檢測(cè)中，酶標(biāo)抗體的最適工作濃

度受到固相載體的性質(zhì)、包被抗原或抗體的純度以及整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)如標(biāo)本、反應(yīng)溫

度和時(shí)間等的影響，因此必須在實(shí)際測(cè)定條件下進(jìn)行"滴配"選擇能達(dá)到高敏感度的

最大稀釋度作為試劑盒中的工作濃度。

3.2.4結(jié)合物的保存酶標(biāo)抗體中的酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保存不當(dāng)，極易失

活。高濃度的結(jié)合物較為穩(wěn)定，冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干

過(guò)程中引起活力的減低，而且使用時(shí)需經(jīng)復(fù)溶，頗為不便。結(jié)合物溶液中加入等體

積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的冰格中較長(zhǎng)時(shí)間保存。早期的ELISA試劑盒中

的結(jié)合物一般均按以上兩種形式供應(yīng)，配以稀釋液（見3.2.5）臨用時(shí)按標(biāo)明的稀釋

度稀釋成工作液?，F(xiàn)在較先進(jìn)的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使

用時(shí)不需再行稀釋，在4-8℃保存期可達(dá)6個(gè)月。由于蛋白質(zhì)濃度較低，結(jié)合物易

失活，需加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結(jié)

合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉），以防止細(xì)菌生長(zhǎng)。

3.2.5結(jié)合物的稀釋液用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反

應(yīng)中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)（例如1%

牛血清白蛋白），通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)以抑制結(jié)合物的吸附。一般還加入具有抑制蛋白質(zhì)吸附于

塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20,0.05%的濃度較為適宜。在間接測(cè)定

抗體時(shí)，血清標(biāo)本需稀釋后進(jìn)行測(cè)定，也可應(yīng)用這種稀釋液。

3.3酶的底物

3.3.1HRP的底物HRP催化過(guò)氧化物的氧化反應(yīng)，最具代表性的過(guò)氧化物為H2O2,

其反應(yīng)式如下：DH2+H2O2D+H2O上式中，DH2為供氧體，H2O2為受

氫體。在ELISA中，DH2一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作

比色測(cè)定。常用的供氫體有鄰苯二胺（O-phenylenediamine,OPD）、四甲基聯(lián)苯胺

（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB）和

ABTS[2,2'-azino-di-（3-ethylbenziazobinesulfonate-6）]?OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅

色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP

結(jié)合物最常用的底物。OPD本身難溶于水，OPD-2HCL為水溶性。曾有報(bào)道OPD

有致異變性，操作時(shí)應(yīng)予注意。OPD見光易變質(zhì)，與過(guò)氧化氫混合成底物應(yīng)用液后

更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制

成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過(guò)氧化氫則

配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時(shí)用蒸儲(chǔ)水稀釋。先進(jìn)的ELISA

試劑盒中則直接配成含保護(hù)劑的工作濃度為0.02%H2O2的應(yīng)用液，只需加入OPD

后即可作為底物應(yīng)用液。TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色，目視對(duì)比鮮明。TMB

性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液，可直接作底物

使用。另外，TMB又有無(wú)致癌性等優(yōu)點(diǎn)，因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)

用HCL或H2s04終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收

波長(zhǎng)為405nmoABTS雖不如0PD和TMB敏感，