SNT 4418-2016 出口食品中駱駝源性成分的檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法

中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)出口食品中駱駝源性成分的檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法I1出口食品中駱駝源性成分的檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中駱駝源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，可以對(duì)食品中駱駝源性成分進(jìn)行定性檢測(cè)，在檢測(cè)范圍和技術(shù)指標(biāo)方面可滿足食品的檢測(cè)需求本標(biāo)準(zhǔn)適用于乳品，新鮮、冷凍和加工的肉品中駱駝源性成分的定性檢測(cè)。本標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定方法的最低檢出限(LOD)為0.01%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)):2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T27403—2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)3.1術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。駱駝camelus偶蹄目駱駝科駱駝屬，包括單峰駱駝和雙峰駱駝在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累立時(shí)監(jiān)控整個(gè)PCR擴(kuò)增過(guò)程，實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量及定性分析。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。下列縮略語(yǔ)適用于本文件。DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonuleicacid)dNTP:脫氧核苷酸三磷酸(deoxyribonuleosidetriphosphate)CTAB:十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrithylammoniumbromide)Tris:三羥甲基氨基甲烷[Tris(Hydroxymethyl)aminomethane]EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid)2引物/探針序列(5′→3')靶基因哺乳動(dòng)物(內(nèi)參照)P:FAM-CAGCCTGGTGTTTGGCACCTCGGAP:(FAM)-CCTACACGAAACAGGYTCTAATAACCCGAC-(pH8.0。5.6酚-三氯甲烷-異戊醇溶液：按照Tris飽和酚：三氯甲烷：異戊醇溶液體積比為25:24:1進(jìn)行5.10蛋白酶K(20mg/mL)。3異丙醇或2倍體積-20℃冰箱中預(yù)冷的無(wú)水乙醇混勻，-20℃放置0.5h～1h,12000g轉(zhuǎn)速下4℃4上述方法均可用等效DNA提取試劑盒提取模板DNA。7.3DNA濃度和純度的測(cè)定使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)26o和A280。DNA的濃度按照式(1)計(jì)算，當(dāng)Azso/A?8o比值在1.7～2.2之間時(shí)，適宜于PCR擴(kuò)增。c=A×N×50/1000A——260nm處的吸光值；N——核酸稀釋倍數(shù)。7.4實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增7.4.1實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照(駱駝DNA),陰性對(duì)照(非駱駝的哺乳動(dòng)物DNA),空白對(duì)照。所有樣品重復(fù)兩次，見(jiàn)表2。表2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系DNA模板(5ng滅菌ddH?(7.4.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)程序50℃,2min;95℃,10min;40個(gè)循環(huán)的95C,15s;60℃min。8.3陽(yáng)性對(duì)照：有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct值≤30.0。8.4內(nèi)參照基因：有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct值≤30.0。9結(jié)果判斷與表述在符合第8章的情況下：56A.1雙峰駝(GenBank:FJ171713.1)ATTCTTTGCCTTCCACTTCATCCTGCCATTTATTATCACGGCCCTAGTATTATTCCTACACGAAACAGGCTCTAATAACCCGACAGGAATCTCAATCCCATTCCACCCCTACTACACAATTAAAGACATCCTAGGAGCACTGCATTCTCCTTATTCTCGTACTGTTCTCACCAGACTTATTAGGAGATCCTGACCGCTAACCCCCTCAATACACCACCACACATTAAGCCGGAATGATATTCTTCGCCTTCCATTTCATCCTACCATTCATTATCACGGCTCTAGTACTATTTCTACACGAAACAGGTTCTAATAACCCAACAGGAATTCAAATCCCATTCCATCCCTATTACACGATTAAAGATA