駐留類化妝品溫和性檢測：基于體外重組3D表皮

ICS71.100.70Y42T/ZHCAXXX-XXXX駐留類化妝品溫和性檢測：基于體外重組3D表皮模型的組織活力法mildnesstestofresidualcosmetics–basedonTissueviabilitymethodofInvitroreconstructedskinmodel（征求意見稿）2021-xx-xx發(fā)布2021-xx-xx實(shí)施浙江省健康產(chǎn)品化妝品行業(yè)協(xié)會?發(fā)布T/ZHCAXXX-XXXX前??言本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院提出。本文件由浙江省健康產(chǎn)品化妝品行業(yè)協(xié)會（ZHCA）歸口。本文件起草單位：浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院、廣東博溪生物科技有限公司、杭州捷諾飛生物科技有限公司、上海家化聯(lián)合股份有限公司。本文件主要起草人：何立成，待定。駐留類化妝品溫和性檢測：基于體外重組3D表皮模型的組織活力法范圍本文件規(guī)定了駐留類化妝品溫和性檢測的一種體外測試方法。本文件適用于用體外重組3D表皮模型-EpiKutis?RHE模型對駐留類化妝品進(jìn)行溫和性測試。本文件可作為駐留類化妝品溫和性宣稱的實(shí)驗(yàn)室方法之一。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法化妝品安全技術(shù)規(guī)范2015版術(shù)語及定義下列術(shù)語和定義適用于本文件駐留類化妝品residualcosmetics除淋洗類產(chǎn)品外的化妝品。溫和性mildness皮膚長時間接觸受試物，未引起可逆性炎性反應(yīng)。體外重組3D表皮模型reconstructedhumanskinmodel以人包皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞，經(jīng)過體外培養(yǎng)，與人表皮組織具有相似結(jié)構(gòu)及功能的三維組織模型。組織活力法reconstructedhumancornea-likeepitheliumtestmethod將受試樣品暴露在表皮模型上，接觸一定時間后，計算模型的存活率。試劑和材料水：符合GB/T6682規(guī)定的三級水。Triton?X-100：CAS號：9002-93-1，分析純。異丙醇：CAS號：67-63-0，分析純。噻唑藍(lán)：CAS號：298-93-1，分析純。磷酸鹽緩沖液（DPBS）：pH7.0~pH7.3，不含鈣、鎂離子。1.0%Triton?X-100溶液：吸取Triton?X-100（4.2）10μL，溶于990μL水中，配制成體積分?jǐn)?shù)為1.0%的Triton?X-100溶液。MTT溶液：稱取噻唑藍(lán)（4.4）20mg，溶于20.0mLDPBS（4.5）中，配制成質(zhì)量濃度為1mg/mL的MTT溶液，臨用現(xiàn)配，避光保存。體外重組3D表皮模型試劑盒：EpiKutis?RHE模型及其培養(yǎng)液。死亡組織模型：將體外重組3D表皮模型置于-20℃環(huán)境下冷凍24h以上。儀器設(shè)備分析天平：分度值為0.0001g。二氧化碳培養(yǎng)箱。超凈工作臺。外置活塞式移液器：100μL。連續(xù)分液器：25mL。計時器。微孔板振蕩器。酶標(biāo)儀。測試方法樣品干擾試驗(yàn)試驗(yàn)前需對駐留類化妝品受試樣品（以下簡稱受試樣品）進(jìn)行樣品干擾試驗(yàn)，出現(xiàn)6.1.1和6.1.2的情況需增加死亡組織模型對照組，如無6.1.1和6.1.2的情況可直接取受試樣品測定。受試樣品與MTT有反應(yīng)取MTT溶液1.0mL，加入受試樣品液體80μL，分別在0h、1h、2h和3h時觀察樣品周邊溶液顏色變化情況。若溶液顏色發(fā)生變化，需增加死亡組織模型對照組。受試樣品有顏色若受試樣品不溶于異丙醇，無需增加死亡組織模型對照組；若受試樣品溶于異丙醇，取受試樣品80μL或固體80mg，溶于2mL異丙醇中，在570nm波長處測定吸光度（OD值），若OD值≥0.15，需增加死亡組織模型對照組。測試步驟體外重組3D表皮模型接收和準(zhǔn)備收到體外重組3D表皮模型（以下簡稱模型）試劑盒后，打開外包裝，肉眼觀察模型與固體培養(yǎng)基接觸界面是否有氣泡，如發(fā)現(xiàn)接觸界面有明顯氣泡，為不合格模型。在超凈工作臺中將合格的模型轉(zhuǎn)移至含0.9mL培養(yǎng)液的無菌6孔培養(yǎng)板，在溫度為37℃±1℃、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%±1%、相對濕度為95%的條件下孵育1h。更換培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育18h后，再次更換培養(yǎng)液。試驗(yàn)分組和加樣試驗(yàn)分為陰性對照組（水）、陽性對照組（1.0%Triton?X-100溶液）和受試樣品組，必要時增加死亡組織模型對照組，每組平行使用3個模型。在室溫（18℃～28℃）條件下，采用外置活塞式移液器輕輕在模型表面均勻涂抹受試樣品80μL，在溫度為37℃±1℃、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%±1%、相對濕度為95%的條件下暴露24h。沖洗暴露結(jié)束后，采用連續(xù)分液器吸取25mLDPBS將模型逐個進(jìn)行沖洗。甲瓚提取將模型轉(zhuǎn)移至含300μLMTT溶液的24孔培養(yǎng)板中，在溫度為37℃±1℃、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%±1%、相對濕度為95%的條件下孵育3h±5min后，轉(zhuǎn)移至新的24孔培養(yǎng)板中，每孔加入2mL異丙醇，用封口膜密封培養(yǎng)板間隙，避免異丙醇揮發(fā)。室溫條件下，將培養(yǎng)板固定在微孔板振蕩器上，振搖2h，提取甲瓚。也可以采取在4℃下過夜的提取方法。OD值的測定提取結(jié)束后，將提取液混合均勻，轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板中，每個組織模型取2個復(fù)孔，200μL/孔，用異丙醇作為溶劑對照。在570nm波長處讀取吸光度（OD值），計算組織的存活率。數(shù)據(jù)處理無死亡組織模型對照組的存活率按式（1）計算。存活率%=有死亡組織模型對照組的存活率按式（2）計算。存活率(%)=(結(jié)果判定試驗(yàn)成立條件陰性對照組OD值在1.0～2.5之間。陽性對照組的存活率＜15%。同一樣品復(fù)孔間SD值小于18%。結(jié)果評價溫和性：存活率≥50%。非溫和性：存活率＜50%。試驗(yàn)報告試驗(yàn)報告至少應(yīng)給出以下幾個方面的內(nèi)容：檢驗(yàn)依據(jù)；樣品和陽性對照組