蛋白質(zhì)結(jié)合相互作用及研究方法

關(guān)于蛋白質(zhì)結(jié)合相互作用及研究方法*DNA

*RNA

*ProteinCellassemblyandfunction/細(xì)胞組裝與功能MessengerHeadquarterExecutorStable,DNAmutationStable/Versatile,rRNA,tRNA,mRNAVersatile,ProteinmodificationProtein-ProteininteractionProtein-Othercomponentinteraction第2頁,共100頁，星期六，2024年，5月已有超過1000個物種的基因組完成測序，大量的新基因不斷被發(fā)現(xiàn)，然而單純的基因組DNA序列尚不能解答許多生命問題?；蚴窍鄬o態(tài)的，而基因編碼的產(chǎn)物—蛋白質(zhì)則是動態(tài)的，具有時空性和調(diào)節(jié)性，是生物功能的主要體現(xiàn)者和執(zhí)行者。蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、存在方式以及相互作用等直接與生物功能相關(guān)。

第3頁,共100頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)序列特點和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)進(jìn)化過程和保守序列蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位及其相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞器蛋白質(zhì)表達(dá)譜蛋白質(zhì)翻譯后修飾情況了解與其相關(guān)聯(lián)的其他細(xì)胞蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)信息的不同層次蛋白質(zhì)之間的相互作用是細(xì)胞進(jìn)行一切活動的基礎(chǔ)。第4頁,共100頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白復(fù)合物是細(xì)胞各種基本功能的主要完成者。幾乎所有的重要生命活動，包括DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分泌、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝等等，都離不開蛋白質(zhì)之間的相互作用。

蛋白質(zhì)間相互作用研究的重要性第5頁,共100頁，星期六，2024年，5月Humanprotein-proteininteraction(PPI)networkTowardsaproteome-scalemapofthehumanprotein–proteininteractionnetworkRual,Vidaletal.Nature437,1173-1178(2005)第6頁,共100頁，星期六，2024年，5月

錯誤的蛋白質(zhì)相互作用可能導(dǎo)致疾病

如Alzheimer’sdisease,beta-淀粉樣結(jié)構(gòu)的堆積（alpha-synuclein與synphilin-1結(jié)合）；

Synphilin-1associateswithalpha-synucleinandpromotestheformationofcytosolicinclusions.NatGenet.1999;22(1):110-4

如尤文氏肉瘤融合蛋白（EWS-FLI1）可黏附于另一個RNA解旋A蛋白（RHA）控制基因轉(zhuǎn)錄。

AsmallmoleculeblockingoncogenicproteinEWS-FLI1interactionwithRNAhelicaseAinhibitsgrowthofEwing'ssarcoma.NatMed.2009;15(7):750-6.第7頁,共100頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)相互作用分析研究思路一、鑒定與某個感興趣的蛋白質(zhì)相互作用的所有可能的蛋白質(zhì)。（暫不考慮生理功能）二、詳細(xì)描述鑒定出蛋白的生物功能及相互作用對其功能的影響。（研究盡可能接近胞內(nèi)條件）三、運用高通量方法鑒定調(diào)節(jié)這種作用的關(guān)鍵因子。第8頁,共100頁，星期六，2024年，5月等離子表面共振技術(shù)SPR免疫共沉淀Co-PIFarWesternblot串聯(lián)親和層析TAP融合蛋白沉降技術(shù)GST-PulldownInvitro酵母雙雜交YeastTwo-hybrid噬菌體展示PhagedisplayInvivo熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究方法蛋白芯片ProteinChip細(xì)胞內(nèi)共定位Cellularcolocalization第9頁,共100頁，星期六，2024年，5月

Two-hybridsystem是90年代初發(fā)展起來的新方法。在真核模式生物酵母中進(jìn)行的，研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過報告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測得到，它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。Saccharomycescerevisiae一、酵母雙雜交系統(tǒng)

1989StanleyField’slabpublishedthefirstreportonYeastTwo-Hybridassay.FieldsS,SongO.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.Nature,1989,340(6230):245-246/sfields/yp_interactions/index.html第10頁,共100頁，星期六，2024年，5月

酵母激活因子GAL4：

N端：147個氨基酸組成的DNA結(jié)合域(DNAbindingdomain,BD)C端：113個氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活域(transcriptionactivationdomain,AD)

DNA結(jié)合域可以和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結(jié)合，而轉(zhuǎn)錄激活域則能激活UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄

。當(dāng)兩者單獨存在時，不能激活轉(zhuǎn)錄；當(dāng)兩者在空間上充分接近時，可以啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄。1985MarKPatshne’slabdemonstratedmodularityofDNAbindingtranscriptionactivators.

第11頁,共100頁，星期六，2024年，5月酵母雙雜交系統(tǒng)的原理ADYADYXDNA-BDGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergenetranscriptionGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneXDNA-BD第12頁,共100頁，星期六，2024年，5月誘餌蛋白（bait）BD-X與BD融合的蛋白表達(dá)載體，其表達(dá)的蛋白

靶蛋白（prey）AD-Y與AD融合的蛋白表達(dá)載體，其表達(dá)的蛋白

宿主菌株經(jīng)改造的、含一個或多個報告基因的重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。Componentsofthesystem載體中加入進(jìn)行營養(yǎng)型篩選的基因第13頁,共100頁，星期六，2024年，5月

基因組中GAL4基因是缺失型的

基因組也不能合成ADE、HIS、LEU、TRP（因此，酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長）改造后的酵母細(xì)胞的特點：第14頁,共100頁，星期六，2024年，5月常見報告基因通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落第15頁,共100頁，星期六，2024年，5月培養(yǎng)基類型pGADT7Amp+-LeupGBKT7Kan+-Trp單缺雙缺四缺第16頁,共100頁，星期六，2024年，5月酵母雙雜交實驗過程第17頁,共100頁，星期六，2024年，5月第18頁,共100頁，星期六，2024年，5月第19頁,共100頁，星期六，2024年，5月第20頁,共100頁，星期六，2024年，5月第21頁,共100頁，星期六，2024年，5月用已知功能蛋白質(zhì)篩選雙雜交cDNA文庫，研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。繪制蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)圖譜(PPI)在藥物設(shè)計中的應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用現(xiàn)狀第22頁,共100頁，星期六，2024年，5月1）發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的新功能將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-文庫載體，并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的cDNA片段，并對該片段的編碼序列在GENEBANK中進(jìn)行比較，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。

第23頁,共100頁，星期六，2024年，5月2）構(gòu)建基因組蛋白連鎖圖（GenomeProtein-proteinInteractionMap，PPI）基因組中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過基因組的測序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和EST序列。利用酵母雙雜交技術(shù)，將所有已知基因和EST序列為誘餌，在表達(dá)文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。對于認(rèn)識一些重要的生命活動：如信號傳導(dǎo)、代謝途徑等有重要意義。第24頁,共100頁，星期六，2024年，5月Genomeprotein-proteinInteractionmap第25頁,共100頁，星期六，2024年，5月第26頁,共100頁，星期六，2024年，5月第27頁,共100頁，星期六，2024年，5月3）篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響

對于能夠引發(fā)疾病反應(yīng)的蛋白相互作用可采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達(dá)到治療疾病的目的。第28頁,共100頁，星期六，2024年，5月酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點高敏感性

①采用高拷貝和強(qiáng)啟動子的表達(dá)載體，使融合蛋白過量表達(dá)；②激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，之后又與啟動子結(jié)合，此三元復(fù)合體使融合蛋白各組分間結(jié)合更趨于穩(wěn)定；③檢測的結(jié)果是基因表達(dá)產(chǎn)物的累積效應(yīng)，可檢測存在于蛋白質(zhì)間的微弱或暫時的相互作用。第29頁,共100頁，星期六，2024年，5月酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點高敏感性。真實性--檢測在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，作用條件與作用力無需模擬，在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實情況。簡潔性--融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。廣泛性--采用不同組織器官細(xì)胞類型和分化時期的材料構(gòu)建cDNA文庫，能分析不同亞細(xì)胞部位和功能的蛋白質(zhì)。第30頁,共100頁，星期六，2024年，5月酵母雙雜交系統(tǒng)中常見問題（一）假陽性較多（二）轉(zhuǎn)化效率偏低（三）陰性干擾第31頁,共100頁，星期六，2024年，5月假陽性定義在待研究的兩個蛋白間沒有發(fā)生相互作用的情況下，報告基因仍被激活。（一）假陽性較多

①BD融合誘餌蛋白的單獨激活作用(自激活現(xiàn)象）②AD融合靶蛋白有DNA的特異性結(jié)合，則可單獨激活報告基因的表達(dá)。③AD融合蛋白直接與轉(zhuǎn)錄因子相互作用激活報告基因；④蛋白過表達(dá)導(dǎo)致非生理情況下的結(jié)合原因：第32頁,共100頁，星期六，2024年，5月排除假陽性的措施

①

作嚴(yán)格的對照試驗。應(yīng)對誘餌和靶蛋白分別作單獨激活報告基因的鑒定。--如存在自激活，雙雜交前刪除該片段，但應(yīng)保留相互作用的結(jié)構(gòu)域②采用多個報告基因，且每個報告基因的上游調(diào)控區(qū)各不相同。--目前多數(shù)載體已采用。進(jìn)一步分析：

①

這種相互作用是否會在細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生。②有些蛋白依賴于泛素的蛋白酶降解途徑成員，它們具有普遍的蛋白間的相互作用。③一些實際沒有相互作用的蛋白但有相同的模體蛋白也可發(fā)生相互作用。第33頁,共100頁，星期六，2024年，5月酵母轉(zhuǎn)化效率較細(xì)菌低4個數(shù)量級，轉(zhuǎn)化成為雙雜交技術(shù)的瓶頸。辦法：引進(jìn)酵母接合型

a接合型和接合型（兩者之間可，但自身不能形成二倍體）（二）轉(zhuǎn)化效率偏低第34頁,共100頁，星期六，2024年，5月菌落篩選藍(lán)白斑篩選第35頁,共100頁，星期六，2024年，5月（三）陰性干擾融合蛋白的表達(dá)對細(xì)胞有毒性，該怎么辦？應(yīng)選擇敏感性較低的菌株或拷貝數(shù)低的載體蛋白間的相互作用較弱，應(yīng)選擇高敏感的菌株或多拷貝載體。蛋白在酵母中不能穩(wěn)定地表達(dá)，或者不能正確地折疊，或雜交蛋白不能轉(zhuǎn)入胞核。在細(xì)胞表面發(fā)生的相互作用可采用噬菌體顯示系統(tǒng)。兩個蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用，但報告基因不表達(dá)或表達(dá)程度甚低以至于檢測不出來。原因：第36頁,共100頁，星期六，2024年，5月

酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法，有多方面的應(yīng)用，但仍存在一些局限性。

雙雜交系統(tǒng)的得到的陽性結(jié)果一定要通過其它的實驗手段來驗證。酵母雙雜交系統(tǒng)使用注意事項第37頁,共100頁，星期六，2024年，5月

在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上，又發(fā)展：酵母單雜交—分析DNA和文庫蛋白之間的作用酵母三雜交--分析蛋白和RNA間的相互作用酵母的反向雜交--兩種蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)和位點。酵母雙雜交相關(guān)技術(shù)第38頁,共100頁，星期六，2024年，5月酵母單雜交系統(tǒng)在酵母單雜交系統(tǒng)中，用特異的DNA序列取代DNAGal4結(jié)合位點。該DNA序列在相關(guān)生物系統(tǒng)中是重要的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。靶DNA序列特異的結(jié)合蛋白(BDPX)與Gal4P的激活結(jié)構(gòu)域作用可激活作為表型選擇性報告基因的表達(dá)。第39頁,共100頁，星期六，2024年，5月酵母單雜交系統(tǒng)應(yīng)用①確定已知DNA-蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。②分離編碼結(jié)合于目的順式調(diào)控元件或其他短DNA結(jié)合位點蛋白的新基因。③定位已經(jīng)證實的具有相互作用的DNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用第40頁,共100頁，星期六，2024年，5月酵母三雜交系統(tǒng)在酵母三雜交系統(tǒng)中，除RNA結(jié)合蛋白-BD和待選的RNA結(jié)合蛋白-AD，還需構(gòu)建一雜合RNA，含有二個不同的蛋白結(jié)合位點。當(dāng)RNA與二個RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點相互作用時可激活報道基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。三雜交系統(tǒng)提供了快速、多用的體內(nèi)檢測RNA-蛋白間相互作用的新方法。。RNA第41頁,共100頁，星期六，2024年，5月反向酵母雙雜交系統(tǒng)

（reverseyeasttwo-hybridsystem）該系統(tǒng)是一項鑒定阻斷蛋白間相互作用的技術(shù)，核心在于構(gòu)建一種反向篩選的報告基因。在這系統(tǒng)中，野生型BD-X/AD-Y間的相互作用激活一種URA3報告基因，使酵母宿主-URA（ura缺失）培養(yǎng)基上生長；但URA3編碼的酶類可以使5-FOA變成對細(xì)胞有毒性的物質(zhì)，使酵母細(xì)胞在含5-FOA的培養(yǎng)基上不能生長。在此情況下BD-X/AD-Y作用的解離賦予酵母一種選擇生長優(yōu)勢。利用這種方法能方便地鑒定作用缺陷等位基因、解離肽或相關(guān)的小分子物質(zhì)。第42頁,共100頁，星期六，2024年，5月-Ura5-FOA這個改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的選擇性培養(yǎng)基上只有當(dāng)“誘餌”和“獵物”相互作用激活URA3基因的表達(dá)才能生長。在含有5-FOA的完全培養(yǎng)基上“餌”和“獵物”的相互作用則抑制細(xì)胞的生長。有相互作用無相互作用++--反向酵母雙雜交系統(tǒng)

（reverse

yeasttwo-hybridsystem）VidalM,BrachmannRK,FattaeyA,HarlowE,BoekeJD.Reversetwo-hybridandone-hybridsystemstodetectdissociationofprotein-proteinandDNA-proteininteractions.ProcNatlAcadSciUSA，1996，93(19):10315-10320.第43頁,共100頁，星期六，2024年，5月反向酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用研究蛋白間作用的關(guān)鍵位點或起決定作用的個別氨基酸，進(jìn)而分析蛋白結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。篩選能阻止某些蛋白間相互作用的肽或小分子物質(zhì)用作臨床治療制劑。利用反向雙雜交系統(tǒng)對文庫進(jìn)行預(yù)清除，則可能大大減輕以后的假陽性鑒定工作。反向雙雜交系統(tǒng)作為正向雙雜交系統(tǒng)的補(bǔ)充，提出了創(chuàng)建整個有機(jī)體蛋白質(zhì)連鎖圖譜的設(shè)想。第44頁,共100頁，星期六，2024年，5月細(xì)菌雙雜交：操作簡單，周期短2-3天可研究膜蛋白或跨膜蛋白相互作用哺乳細(xì)胞雙雜交：蛋白有翻譯后修飾，可正確地折疊報告基因：熒光素酶，堿性磷酸酶和

-半乳糖苷酶酵母雙雜交相關(guān)技術(shù)第45頁,共100頁，星期六，2024年，5月Figure.Schemaofthehigh-throughputyeasttwo-hybridpipeline.Nature.2005Oct20;437(7062):1173-8.Towardsaproteome-scalemapofthehumanprotein-proteininteractionnetwork.Example第46頁,共100頁，星期六，2024年，5月theleaderinenzymetechnology二、噬菌體展示技術(shù)是一項篩選技術(shù)，將目標(biāo)蛋白的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面。被展示的多肽或蛋白質(zhì)可保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。Smith在1985年首次證實外源DNA可以插入絲狀噬菌體基因III中，并與pIII蛋白融合展示。

SmithGP.Science1985;228:1315-7/smithgp/PhageDisplayWebsite/PhageDisplayWebsiteIndex.html第47頁,共100頁，星期六，2024年，5月展示系統(tǒng)不同分為：M13噬菌體展示系統(tǒng)、T7噬菌體、T4噬菌體與

-噬菌體展示系統(tǒng)噬菌體展示系統(tǒng)的分類：絲狀噬菌體蝌蚪形噬菌體λ噬菌體、T4噬菌體、T7噬菌體M13噬菌體第48頁,共100頁，星期六，2024年，5月展示內(nèi)容（文庫）不同包括：隨機(jī)肽段文庫、天然肽段文庫、cDNA文庫、抗體文庫（抗體片段）、蛋白質(zhì)文庫等噬菌體展示系統(tǒng)的分類：第49頁,共100頁，星期六，2024年，5月theleaderinenzymetechnologyLifeCycleofM13

以dsDNA為模版合成所有的病毒蛋白，且通過滾環(huán)復(fù)制合成組裝病毒所需的ssDNA。

基因組編碼11種蛋白質(zhì)，其中5種為結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。與展示密切相關(guān)的有兩種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)（主要衣殼蛋白pVIII和次要衣殼蛋白pIII）。

感染宿主后通常不裂解宿主細(xì)胞，而是從感染的細(xì)胞中分泌出噬菌體顆粒，第一代噬菌體在感染10分鐘后出現(xiàn)在培養(yǎng)液中（37oC）。感染后1小時內(nèi)平均每個細(xì)胞分泌1000個噬菌體。第50頁,共100頁，星期六，2024年，5月theleaderinenzymetechnology主要衣殼蛋白pVIII和次要衣殼蛋白pIIIPIIIPVIII展示多肽～300aa<10aa展示數(shù)量低價（約5個拷貝）高價（高達(dá)2700個拷貝）配體結(jié)合力親和力非常低高親和力插入部位N端、近N端或N端與C端的柔性連接區(qū)融合N端或近N端融合衣殼蛋白第51頁,共100頁，星期六，2024年，5月GeneralselectionschemeforcDNAexpression-productsdisplayedonphagesurface.Konthuretal2003TARGETSVol.2,No.6261-270.噬菌體展示操作流程第52頁,共100頁，星期六，2024年，5月噬菌體展示技術(shù)的優(yōu)點非展示系統(tǒng)展示系統(tǒng)第53頁,共100頁，星期六，2024年，5月噬菌體展示技術(shù)的優(yōu)點特定分子的基因型和其表型統(tǒng)一在同一個噬菌體顆粒內(nèi)，將重組蛋白質(zhì)篩選與基因篩選合二為一。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，以利于靶分子的識別和結(jié)合。淘選的高效率使陽性克隆在微量存在的情況下，通過感染得到擴(kuò)增富集。操作簡單易行，在幾周內(nèi)即可篩選106～108克隆噬菌體隨機(jī)肽庫具有容量大、體積小、篩選簡便、制備成本低、可多次擴(kuò)增等突出優(yōu)點。第54頁,共100頁，星期六，2024年，5月噬菌體展示技術(shù)的局限性所建庫的容量（109）和分子多樣性受到限制；噬菌體展示文庫一旦建成，很難再進(jìn)行有效的體外突變和重組，進(jìn)而限制了文庫中分子遺傳的多樣性。由于噬菌體展示系統(tǒng)依賴于細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)，所以，一些對細(xì)胞有毒性的分子如生物毒素分子，很難得到有效表達(dá)和展示。少數(shù)多肽由于疏水性，或由于影響外膜蛋白的折疊而不能展示在噬菌體表面。第55頁,共100頁，星期六，2024年，5月噬菌體展示的應(yīng)用????抗原表位分析蛋白質(zhì)相互作用位點的確定人工抗體和疫苗的制備酶抑制劑的研究開發(fā)多肽藥物的研制第56頁,共100頁，星期六，2024年，5月TargetingPlasmodiumligandsonmosquitosalivaryglandsandmidgutwithaphagedisplaypeptidelibraryProcNatlAcadSciUSA.2001;98(23):13278–13281.Figure1.Schematicillustrationoftheselectionprotocolforphagesthatbindeithertosalivaryglands(a)ortotheluminalsideofthemidgutepithelium(b).Example第57頁,共100頁，星期六，2024年，5月三、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)

當(dāng)供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個分子的距離在10nm范圍以內(nèi)時，就會發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，即FRET現(xiàn)象，使得供體的熒光強(qiáng)度比它單獨存在時要低的多（熒光猝滅），而受體發(fā)射的熒光卻大大增強(qiáng)（敏化熒光）。FRET技術(shù)是目前唯一能對固定細(xì)胞中的蛋白質(zhì)間相互作用或存在于活細(xì)胞蛋白質(zhì)間相互作用，提供定位和定量信息的技術(shù)。第58頁,共100頁，星期六，2024年，5月FRET熒光能量轉(zhuǎn)移第59頁,共100頁，星期六，2024年，5月FRET熒光能量轉(zhuǎn)移有三個基本條件：給體與受體在合適的距離（1～10nm）；給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有一定的重疊（這是能量匹配的條件）；給體與受體的偶極具有一定的空間取向（這是偶極-偶極耦合作用的條件）。第60頁,共100頁，星期六，2024年，5月

1)熒光蛋白:

一類能發(fā)射熒光的天然蛋白及其突變體。

BFP/GFP,CFP/YFP.

常用的探針

ColordefiningGFPBlue(BFP)Green(GFP)Cyan(CFP)Yellowish(YFP)Red(D.s.RFP)Excitation(max)382nm434nm488nm514nm558nmEmission(max)446nm476nm509nm527nm583nmSensitivitytophotobleachingHighLowLowModerateLow第61頁,共100頁，星期六，2024年，5月

2)傳統(tǒng)有機(jī)染料:

具有特征吸收和發(fā)射光譜的有機(jī)化合物組成的染料對。包括熒光素和青色染料Cy3/Cy5等。（優(yōu)先選擇）

3)鑭系染料:

稀土染料,一般與有機(jī)染料聯(lián)用，分別作為FRET的供體和受體，以提高檢測的準(zhǔn)確性和信噪比。

4)量子點:

量子點是一種能接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的納米顆粒。激發(fā)和放射光譜寬，

發(fā)射熒光強(qiáng)（20倍），穩(wěn)定（100倍）。常用的探針

第62頁,共100頁，星期六，2024年，5月FRET常見的供體-受體熒光分子對：熒光蛋白類：染料類：CFP-YFPBFP-GFPBFP-YFPCFP-DsRFPGFP-DsRFPCFP-YFP-mCherry第63頁,共100頁，星期六，2024年，5月均相檢測（無分離和洗滌步驟）實時連續(xù)地觀察活細(xì)胞的動態(tài)變化FRET技術(shù)的優(yōu)勢和缺點FluorescenceIntensityTime

LigandCy3Cy5熒光強(qiáng)度隨時間衰減，有時間限制；采集信號有噪音缺點：第64頁,共100頁，星期六，2024年，5月

假陰性問題

轉(zhuǎn)染效率，尤其是目標(biāo)蛋白是膜蛋白時配對的供體和受體之間距離和方向不合適，即便形成復(fù)合物，F(xiàn)RET也不會產(chǎn)生；

儀器的敏感度、分辨率、及影像采集和分析能力

假陽性的問題

沒有相互作用的供體和受體之間相隔很近的話，也可以發(fā)生FRET；

所以，應(yīng)結(jié)合多種蛋白相互作用的研究方法（如免疫共沉淀）

FRET熒光能量轉(zhuǎn)移應(yīng)注意問題：第65頁,共100頁，星期六，2024年，5月FRET應(yīng)用范圍

酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體展示系統(tǒng)所篩選克隆的復(fù)證蛋白質(zhì)—核酸相互作用酶活性分析 離子通道研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究第66頁,共100頁，星期六，2024年，5月TechniqueExtension-

Bimolecularfluorescencecomplementation

(BiFC,雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù))

AVisualSystemtoInvestigateProtein-ProteinInteractionsBiFC技術(shù)是將熒光蛋白（GFP、YFP、CFP）分割成兩個不具有熒光活性的分子片段，再分別與目標(biāo)蛋白連接。如果兩個目標(biāo)蛋白因為有相互作用而接近，就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基因而發(fā)出熒光。在熒光顯微鏡下，就能直接觀察到兩目標(biāo)蛋白是否具有相互作用，對研究蛋白質(zhì)相互作用有重要意義。Huetal.,Mol.Cell9,789–798(2002).第67頁,共100頁，星期六，2024年，5月可以在最接近活細(xì)胞生理狀態(tài)的條件下觀察到相互作用的蛋白發(fā)生的時間、位置、強(qiáng)弱、所形成蛋白復(fù)合物的穩(wěn)定性，以及細(xì)胞信號分子對其相互作用的影響等。第68頁,共100頁，星期六，2024年，5月四、細(xì)胞內(nèi)共定位實驗

(Cellularlocalization)直觀，可以看到兩種有相互作用的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布以及共定位的部位

蛋白質(zhì)細(xì)胞內(nèi)定位結(jié)果較為直觀地反應(yīng)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的活動狀態(tài)

第69頁,共100頁，星期六，2024年，5月有色熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)步驟也可稱為活細(xì)胞定位分別克隆X，Y至熒光蛋白載體中共轉(zhuǎn)染表達(dá)GFP/RFP融合蛋白confocalmicroscopy共聚焦顯微鏡法第70頁,共100頁，星期六，2024年，5月第71頁,共100頁，星期六，2024年，5月檢測細(xì)胞內(nèi)源性蛋白的定位及相互作用一抗，二抗（熒光素標(biāo)記）“靶蛋白一抗二抗”免疫復(fù)合物對照的嚴(yán)格設(shè)置利用雙色或多色染色的免疫熒光技術(shù)進(jìn)行蛋白定位步驟第72頁,共100頁，星期六，2024年，5月第73頁,共100頁，星期六，2024年，5月其它研究方法的基本原理第74頁,共100頁，星期六，2024年，5月五、融合蛋白沉降技術(shù)

(如：GSTPulldown)

利用GST對谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖球珠的親和性，從混合蛋白質(zhì)樣品中純化得到相互作用蛋白。第75頁,共100頁，星期六，2024年，5月GSTpulldown第76頁,共100頁，星期六，2024年，5月一確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間的新的相互作用；一是鑒定兩個已知蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。融合蛋白沉降技術(shù)的應(yīng)用第77頁,共100頁，星期六，2024年，5月

操作簡便，如果用抗GST抗體檢測或生物素標(biāo)記融合蛋白避免了使用同位素等危險物質(zhì)。

融合蛋白具有高通量性、高選擇性的特點，由于融合蛋白的多樣性以及表達(dá)系統(tǒng)的多樣性(如細(xì)菌、果蠅、哺乳動物)，該方法能夠研究蛋白質(zhì)在復(fù)雜體系中的相互作用。

融合蛋白沉降技術(shù)的優(yōu)點第78頁,共100頁，星期六，2024年，5月該方法的成功應(yīng)用取決于是否能夠得到足夠多，并且保持蛋白質(zhì)活性的重組融合蛋白。

只用于確定體外的相互作用，還應(yīng)當(dāng)在體內(nèi)用單獨的方法，如免疫共沉淀加以證實。

此方法常用來驗證酵母雙雜交試驗所得到的相互作用。融合蛋白沉降技術(shù)的局限性第79頁,共100頁，星期六，2024年，5月

利用抗原抗體作用的專一性為基礎(chǔ)。可用于鑒定兩種興趣蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)存在相互作用；也用于鑒定一個特定蛋白質(zhì)的未知相互作用蛋白。六、免疫共沉淀技術(shù)Co-immunoprecipitation(Co-IP)第80頁,共100頁，星期六，2024年，5月免疫共沉淀YABAYBY非生理性結(jié)合生理性結(jié)合非特異性結(jié)合原理：細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能沉淀下來。第81頁,共100頁，星期六，2024年，5月實驗的關(guān)鍵1、

實驗最需要注意點就是抗體的性質(zhì)。2、為防止蛋白的分解、修飾，溶解抗原的緩沖液必須使用蛋白酶抑制劑，低溫下(4C)進(jìn)行實驗。合理設(shè)置對照，避免非特異性結(jié)合。使用對照抗體：鼠單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗兔多克隆抗體：正常兔IgG第82頁,共100頁，星期六，2024年，5月優(yōu)點：1、相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；2、蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；缺點：1、可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)相互作用；2、兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，可能有第三者在中間起橋梁作用；

3、如用westernblot檢驗，必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體。免疫共沉淀技術(shù)的優(yōu)缺點第83頁,共100頁，星期六，2024年，5月PlasmidsconstructTranscription;Translation;MixtranslatedproductsIncubationwith

ONEantibodyElutionandseparationwithSDSAnti-cMycAnti-HA用免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù)驗證酵母雙雜交獲得的結(jié)果第84頁,共100頁，星期六，2024年，5月1999年Rigaut等人共同提出了一套分離復(fù)合蛋白的新方法—串聯(lián)親和純化(Tandemaffinitypurification，TAP)，兼具標(biāo)準(zhǔn)親和純化（可以得到高純度地拷貝數(shù)的蛋白質(zhì)復(fù)合體）和免疫共沉淀（用于特異性的標(biāo)記蛋白與親和柱之間的相互作用）兩種生化方法的優(yōu)點，為蛋白質(zhì)復(fù)合體的分離鑒定提供了一條新路徑。

適用于：研究蛋白質(zhì)復(fù)合體中多個蛋白質(zhì)間的相互作用，特別適用于研究蛋白質(zhì)在生理條件下的相互作用七、串聯(lián)親和層析TAP第85頁,共100頁，星期六，2024年，5月RigautGetal.,NatureBiotechnology17,1030-1032(1999)串聯(lián)親和層析靶蛋白結(jié)合于IgG珠子充分洗滌后，在TEV蛋白酶作用下洗脫結(jié)合物鈣離子存在下，將首次洗脫物中的蛋白質(zhì)結(jié)合于鈣調(diào)蛋白包被的珠子上充分洗滌后，加入EGTA洗脫結(jié)合物第86頁,共100頁，星期六，2024年，5月TAP中常用標(biāo)簽第87頁,共100頁，星期六，2024年，5月

TAP優(yōu)點：1、相互作用發(fā)生在天然環(huán)境和細(xì)胞部位，可以分離和分析多組分的復(fù)合物。2、標(biāo)簽的高度特異性以及采用兩步洗脫純化法，可以更好地保持較不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)復(fù)合物，降低非特異蛋白的結(jié)合。3、步驟簡單、可量化、可獲得大量蛋白質(zhì)。TAP缺點：1、傾向于分離高豐度和穩(wěn)定的相互作用蛋白，許多低親和力、瞬時和依賴特殊細(xì)胞環(huán)境的相互作用可能檢測不到。2、必須采用TAP標(biāo)簽的蛋白，在哺乳動物細(xì)胞中，高于生理水平的誘餌蛋白而產(chǎn)生假陽性。

第88頁,共100頁，星期六，2024年，5月TAP與質(zhì)譜結(jié)合（TAP-MS)第89頁,共100頁，星期六，2024年，5月核糖體蛋白代謝酶類熱休克蛋白泛肽酶高豐度的細(xì)胞骨架蛋白血清蛋白（如果使用是IP親和的方式）MSafteraffinitypurification鑒定結(jié)果中通常包含很多非特異的蛋白質(zhì)信