AbMole 人源化單抗動物實驗黃金指南(上)

AbMole|人源化單抗動物實驗黃金指南(上)單克隆抗體以其高特異性和單一性的生物學功能，在治療腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反應等多種疾病上發(fā)揮著強大的作用。在新藥研發(fā)和基礎科研領域，越來越多的重點項目也焦距在了人源化單抗的開發(fā)和拓展運用上。接下來，AbMole將通過2期原創(chuàng)性綜述為您展示各種人源化單抗在不同品系小鼠中體內實驗的精華，希望以我們的專業(yè)精神為您鋪就通往成功的道路！首先，我們先了解一下人源化單抗抑制劑動物試驗中常用到的不同品系的小鼠：近交系小鼠通過連續(xù)多代近親交配繁殖后獲得的基因高度純合化小鼠。常見的品系有：BALB/c（白色）和C57BL（黑色）。具有相對完整的鼠源免疫系統(tǒng)（如B淋巴細胞、T淋巴細胞和NK淋巴細胞等），與鼠類移植腫瘤組織相容。如使用此類近交系小鼠進行動物實驗，需確定所用人源化單抗抑制劑對鼠類對應靶點可識別且有活性。Nude小鼠先天性胸腺缺陷的突變的體毛稀少小鼠，其免疫系統(tǒng)特征為：先天性無胸腺，缺少T細胞，T細胞功能明顯有喪失；但B細胞功能正常；NK細胞活力增強。是常用的異種移植動物（如永生化人腫瘤細胞的接種和生長）。SCID小鼠有自發(fā)重度聯合免疫缺陷突變的白化品系小鼠，由于該突變妨礙了T細胞和B細胞的發(fā)育和成熟，所以該品系小鼠的B淋巴細胞和T淋巴細胞功能聯合缺失，但卻擁有正常的NK細胞和巨噬細胞等。是PDX（Patient-DerivedtumorXenograft，人源腫瘤異種移植）模型的良好宿主。NOD-SCID小鼠在SCID小鼠基礎上，與非肥胖性糖尿病小鼠（NOD/Lt）品系回交后得到的免疫缺陷型小鼠。除T和B淋巴細胞缺乏外，同時NK細胞的活性也很低，因此其較少發(fā)生免疫排斥反應及移植物抗宿主?。℅VHD）。大家可以看出從近交系小鼠到NOD-SCID小鼠，其免疫水平是依次降低的。在NOD-SCID小鼠基礎之上，人們又進一步構建了人源化小鼠，用以模擬人體免疫細胞應答的微環(huán)境和探索免疫系統(tǒng)與人類腫瘤細胞或組織之間的相互作用。常見的人源化小鼠有如下2種：a.CD34+人源化小鼠。該品系小鼠可以通過移植人臍帶血CD34+細胞，在免疫缺陷鼠NOG/NPG體內重建免疫系統(tǒng)后獲得。特別適用于免疫腫瘤學、傳染病、宿主-抗體疾病的長期研究。b.PBMC（外周血單核細胞）人源化小鼠。該品系小鼠則多通過靜脈注射或腹腔注射分離的人外周血單核細胞入免疫缺陷鼠并重建免疫系統(tǒng)后獲得。適合用于研究T細胞調節(jié)的藥物及感染和免疫排斥研究。上述兩種人源化小鼠本質上是通過將人的免疫細胞注射入免疫缺陷型小鼠中，在小鼠體內重建并模擬人體免疫系統(tǒng)。每次實驗均需單獨構建。人源化（基因工程）小鼠該品系小鼠并不直接引入大量的人免疫細胞，而是針對性地將小鼠特定的靶點蛋白或其胞外段（如CTLA4和PD-1等）人源化形成轉基因小鼠。這種形式的人源化小鼠在很多情況下是可遺傳的。

在了解了不同小鼠模型的區(qū)別之后，我們一起來看看各單抗抑制劑在動物實驗中的使用吧。Avelumab

(產品編號M3813)Avelumab是一種獨特的強ADCC活性的PD-L1全人源化抗體，能有效地阻止PD-L1與PD-1的結合。因為Avelumab與人和小鼠的PD-L1都有很高的親和力，所以構建腫瘤模型時使用的是C57BL品系小鼠。首先將MB49親代細胞經皮下注射至C57BL/6小鼠體內，待腫瘤長至適當體積。將Avelumab及同型對照都經DPBS稀釋后用于注射。對荷瘤小鼠進行腹腔注射3次，每次間隔3天。由于Avelumab是人IgG1，因此必須在7-9天的窗口內集中注射3次，以避免中和小鼠抗人Ig的出現。結果表明，Avelumab可明顯抑制MB49的腫瘤生長，并提高小鼠存活率。參考文獻：SystemicImmunotherapyofNon–MuscleInvasiveMouseBladderCancerwithAvelumab,anAnti–PD-L1ImmuneCheckpointInhibitorTrastuzumab(產品編號M6218)Trastuzumab是人源化單抗抑制劑，與HER2的胞外區(qū)域相結合，適用于人源或免疫缺陷型小鼠。從EC病人處獲得的ESCC組織移植到SCID小鼠體內。90天后再從這些小鼠體內將ESCC外植體取出并進一步移植到裸鼠體內，以此進行3代鼠傳鼠的移植后，基本穩(wěn)定建立具有HER2表達差異和PIK3CA基因突變的病人來源的食管鱗狀細胞癌外植體(PDECX)小鼠模型。將PDECX小鼠分為對照組和實驗組，實驗組的小鼠接受Trastuzumab的單藥治療（腹膜注射，每周4mg/kg/兩次）或Trastuzumab與AKT抑制劑AZD5363的組合（口服給藥，每天120mg/kg/兩次）治療。每周兩次檢測裸鼠的皮下腫瘤和小鼠體重。結果表明，PIK3CA基因突變且HER2表達陽性的PDECX小鼠對Trastuzumab或AZD5363的單獨治療不敏感，但Trastuzumab與AZD5363的聯合治療能明顯地抑制該腫瘤的生長。參考文獻：Trastuzumabanti-tumorefficacyinpatient-derivedesophagealsquamouscellcarcinomaxenograft(PDECX)mousemodelsNivolumab

(產品編號M6100)Nivolumab是一種通過基因工程改造的、人類免疫球蛋白(Ig)G4單克隆抗體，靶向具有負向免疫調節(jié)功能的人類細胞表面受體程序性死亡-1（PD-1,PCD-1），適用于人源小鼠。首先分離收集人的淋巴細胞，并通過尾靜脈注射將其注入NPG小鼠體內以構建PBMC人源化小鼠。待小鼠血液中人CD45陽性細胞超過25%后，為小鼠皮下接種KHOS細胞，并每隔5天以10mg/kg的劑量腹膜內注射無菌鹽水或Nivolumab，總共注射五次。結果表明，Nivolumab能夠抑制體內骨肉瘤轉移。同時，Nivolumab治療組的肺轉移淋巴結明顯少于對照組。參考文獻：PD-1axisexpressioninmusculoskeletaltumorsandantitumoreffectofnivolumabinosteosarcomamodelofhumanizedmouseAdalimumab

(產品編號M6222)Adalimumab是靶向TNF-alpha的人源化單克隆抗體，抑制TNF-alpha，適用于人源及非人源化小鼠。首先將有BALB/c背景的SKG小鼠進行分組，一部分腹腔內注射經PBS稀釋的Curdlan，另一部分僅注射PBS。然后再將一半數量的注射了Curdlan的小鼠給與Adalimumab的治療。結果顯示，Adalimumab能很明顯地改善由Curdlan誘導的SKG小鼠外周關節(jié)炎。參考文獻：EffectoftumornecrosisfactorinhibitiononspinalinflammationandspinalankylosisinSKGmiceAtezolizumab

(產品編號M6101)Atezolizumab是人源、IgG1單克隆抗體，阻止PD-L1與PD-1和B7.1的相互作用，但不影響PD-L2與PD-1的相互作用，適用于人源及非人源化小鼠。首先將CT26細胞經皮下注射入BALB/C小鼠體內，待腫瘤長至適當體積，再將Atezolizumab或對照IgG經腹膜注射入小鼠。之后收集腫瘤，并檢測其中活細胞上CD80或CD86的表面表達。結果表明，Atezolizumab能夠很好地消耗腫瘤浸潤APC上的CD80。參考文獻：PD-L1:CD80Cis-HeterodimerTriggerstheCo-stimulatoryReceptorCD28WhileRepressingtheInhibitoryPD-1andCTLA-4PathwaysBevacizumab

(產品編號M6166)Bevacizumab是一種人源化血管內皮生長因子（VEGF）抗體，適用于人源及非人源化小鼠。將Nluc-H1915細胞皮下接種入SCID小鼠構建腫瘤模型。當腫瘤長至適當體積時，隨機分為對照組和實驗組，分別以5mg/kg的劑量每周一次注射HuIgG和Bevacizumab。在第22天檢測腫瘤體積以及Nluc活性。結果表明，接受Bevacizumab治療的小鼠腫瘤平均體積以及平均Nluc活性均顯著低于對照組。參考文獻：Bevacizumabsuppressesthegrowthofestablishednon-small-celllungcancerbrainmetastasesinahematogenousbrainmetastasismodel

Ipilimumab

(產品編號M6104)Ipilimumab(MDX-010,BMS-734016)是一種免疫調節(jié)單克隆抗體，靶向細胞表面抗原CTLA-4；也是一種免疫檢查點抑制劑。培養(yǎng)來自于正常健康白細胞供體的外周血單核細胞（PBMC），并用不同濃度的SEB刺激。然后將10μg/mL的Ipilimumab，Nivolumab或HuIgG4同種型對照加入其中。第3天通過ELISA測量IL-2分泌。結果表明，在SEB刺激的PBMC培養(yǎng)物中，雖然單獨使用Nivolumab或Ipilim