征求意見稿《基于FFPE樣本的非小細胞肺癌相關基因突變高通量測序檢測方法》

1基于FFPE樣本的非小細胞肺癌相關基因突變高通量測序檢測方法本標準規(guī)定了采用高通量測序技術對福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織樣本進行非小細胞肺癌（NSCLC）相關基因突變的檢測方法和操作流程，以及本標準適用于臨床醫(yī)學領域中涉及高通量基因測序項目研發(fā)和應用的醫(yī)療衛(wèi)生機構、第三方檢測本標準適用于擬接受靶向治療的浸潤性腺癌或含腺癌成分的NSCLC患者，包括IB-III期術后和晚期范疇，采用同樣的治療模式，缺乏個體化和具體的治療策略。因此本標準僅包含NSCLC相關內學會肺癌臨床診療指南（2023版），NCCNClinicalPracticeGuidelinesinOncology:Non-SmallGB/T42216.3—2022/ISO20166—3:2018分子體外診斷檢驗福爾馬林固定及石蠟包埋組織檢驗前3.1高通量測序High-throughpu又稱為二代測序（Next-generationsequencing，NGS），能3.2280%-85%，主要分為鱗狀細胞癌、腺癌、3.3福爾馬林固定石蠟包埋Formalin-fixedparaffinembedde[來源：GB/T42216.3-2022/ISO20166-3.4擴增子測序Ampliconsequ使用多對引物進行的PCR反應對目標序列進行擴增，并對產生的核酸產物進行高通量測序。引物是[來源：T/GDPMAA0012—2023高通量基因測序項目分類3.5探針是指能夠特異性結合靶序列且?guī)в刑厥鈽撕灥墓押塑账釂捂湣Ｌ结槻东@是指通過設計合成有3.63.7參考序列目標區(qū)域中被樣本測序序列覆蓋的比例（測序覆蓋率=目標區(qū)域內測序序列覆蓋長度÷參3.83.9FASTQ是基于文本的、保存生物序列（通常是核酸序列）和其測序質量信息的、每四行表示一條序3.10SAM是基于文本的、存儲核酸序列和其測序質量信息的、以每一行表示一條序列、每行以制表符分割成11列的準格式，測序質量信息使用ASCII字符表示，BAM是SAM格式的二進制格式，SAM和BAM可作為3[來源：GB_T35890-2018，3.11堿基識別質量Qualityofbasecal基識別錯誤率負相關，二者遵循對數函數關系。堿基識別質量值越高，錯誤率越低。如Q30指測序數據中，堿基識別質量值為30的堿基識別準確率為99.9%，或錯誤率3.12[來源：GB_T35890-2018，3.133.14單核苷酸變異Singlenucleoti簡稱SNV，在基因組DNA上某一位置的單個核苷酸3.153.16拷貝數變異Copynumbervari簡稱CNV，一般指長度為1kb以上的基因組大片段的拷貝數增加或者減少，通常由基因組內的部分3.17床單基因遺傳病基因檢測報告規(guī)范》，參考并4縮略語CNV：拷貝數變異（CopynumbervariDNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicacFFPE：福爾馬林固定石蠟包埋（Formalin-fixedpaIndel：插入或缺失型變異（InsertionNGS：高通量測序/二代測序（High-throughputsequencing/Next-generatioNSCLC：非小細胞肺癌（Non-smallce4UTR：非編碼區(qū)（Untranslatedregi5實驗室分區(qū)、儀器設備及試劑最大限度地降低污染導致假陽性結果的風險。應根據Pre-PCR和Post-PCR階段的不同工作內容劃分獨立格的分區(qū)，并保證無菌無RNase污染，防實驗室的空氣流向或者通風應作為實驗室防污染的強制要求，工作流程和空氣流向按照單一方向分子病理實驗室建設規(guī)范》，《醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗工作導則》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)[2010]1生物安全柜(Ⅱ級或Ⅱ級以上）。5文庫制備試劑：試劑盒內至少應包含連接頭、連接酶、聚合酶、實驗室建設規(guī)范》，《中華醫(yī)學會肺癌臨床診療指南(2023版)》]參考國內外肺癌相關指南和專家共識，應至少檢測與NSCLC發(fā)生和發(fā)展密切相關，并且與靶向治療檢測內容應至少覆蓋NSCLC診療中具有明確臨床意義的變異位點：EGFRL8ERBB2Amplification、METEx14skipping、METAmplification、ALKG1202R、NTRK1G595R、ALK/ROS1/RET/NTRK1/NTRK2/NTRK3fusion。及其變異位點，同時擴展核心基因罕見位點檢測。如KRAS基因第2、3號外顯子熱點突變，NSCLC癌癥通Burden，TMB）用于指導免疫治療，則靶向測序Panel覆蓋范圍原則上不應少于300個基因檢測，覆蓋基因組序列區(qū)域不宜<1.0Mb，并建議與外顯子組測序（WES）基因組區(qū)域應包括但不局限于基因的編碼區(qū)、UTR區(qū)域以及基因內含子區(qū)域發(fā)生的已知熱點突變或專家共識（2023版）》]6.2檢測方法設計鑒于DNA和RNA樣本本身的特點及可檢測的變異類型的差異，DNA和RNA樣本需區(qū)別對待。鑒于NGS技染色體易位/融合等。可選擇采用多重PCR方法或探針捕獲方法，對相應基因組DNA片段進行富集。6前，檢測實驗室需充分了解多重PCR方法和探針捕獲方法的優(yōu)勢和局限性，明確該檢測產品所采用的技和indel檢測或者基因表達水平檢測等。RNAseq分為靶向RNA測序和全轉錄組測序；靶向RNA測序可選擇每個特定變異應設計至少1對擴增引物，特定基因變異的擴增序列特異性要高，引物長度一般為18至24個堿基，各引物之間不能互補，應避免非特異性擴增或引物二聚體。多重PCR的反應體系也會影響/陽性樣本進行驗證。擴增子檢測的特定基因變異包括但不局限于EGFRT790M等每個基因/變異區(qū)域應設計一定數目的捕獲探針進行覆蓋，捕獲探針是指跟目標基因序列互補的一段DNA或者RNA片段，通過與基因組DNA進行雜交，將目標區(qū)域進行捕獲并富集后，使用主流的二代測序由于基因組中的高GC、重復序列等復雜結構的存在，有些區(qū)樣本類型為來源于非小細胞肺癌患者肺部或轉移部位腫瘤組織的FFPE樣本。樣本采集應遵循以下7.2樣本驗收標準a)樣本來源：主要包括手術、纖維支氣管鏡下活檢、CT引導下肺穿刺、胸腔鏡、淋巴結穿刺活c)樣本外觀：FFPE蠟塊或切片，白片或蠟卷數量應根據切片厚度和組織大小適當增d)樣本大小：腫瘤組織應滿足規(guī)定的大小，用于分子檢測的穿刺樣本應≥1條，長度≥0.5cm。e)腫瘤含量：腫瘤細胞占比應滿足檢測要求即≥20%。若腫瘤細7GB/T42216.3-2022/ISO20166-3:8.2樣本前處理以及核酸提取樣本在提取核酸前，首先檢查驗收樣本合格，并且確認腫瘤細胞含量滿足檢測質控要求（建議≥核酸保存：由于DNA和RNA的化學結構和穩(wěn)定性存在差異，其保存條件應獨立設置。DNA應保存在含有Tris-HCl成分的緩沖液中，可在4℃的環(huán)境中短期保存（1個月內），在-20℃的環(huán)境中長期保存（數保存（1個月內），在-80℃的環(huán)境中長期保存（數個月到數年），如有必要還可添加RNA穩(wěn)定劑以降低8.3文庫構建擴增子建庫法：以DNA樣本為建庫模板時，使用特異性引物直接對基因組DNA中目標區(qū)域進行多重PCR擴增，并通過PCR或連接的方式將與二代測序平臺相匹配的接頭和區(qū)分樣本的測序標簽添加至目標引物取決于具體的應用目的），然后使用特異性引物直接對cDNA中目標區(qū)域進行多重PCR擴增，再通過PCR或連接的方式將與二代測序平臺相匹配的接頭和區(qū)分樣本的測序標簽添加至目標序列，以制備成文庫；由于使用特異性引物進行擴增時特異性比較高，對RNA樣本進行核糖體RNA和/或珠蛋白mRNA的去除步驟并不是必須的，具體是否需要主要根據整體檢測方法對靈敏度、特中可能包括逆轉錄、片段化、一鏈/二鏈生成等多個過程，這些過程的具體順序和操作流程取決于檢測8并針對目標區(qū)域進行液相雜交捕獲和擴增，以制備成文庫；對于來源于組織樣本的RNA，通常需要對核糖體RNA進行去除，具體操作需要根據整體檢測方法對靈敏度、特異性等的要求和目標而9數據處理和分析括原始測序序列FASTQ文件、待分析序列SAM/BAM文件、原始變異結果VCF文件、以及變異注釋和質量報9.2測序數據質量控制質量控制指標；對于檢測樣本數據，應使用表1中建議的例9a且堿基排列完全相同的序標區(qū)域中測序深度不低于測序片段的實際大小,即插入本的數據范圍進行閾值設定andtheCollegeofAmericanPathologists》]10.1方案選擇可以由廠商、方法的研究和開發(fā)者或檢測實驗室完成，目的是滿足檢驗預期用途的特定要10.2性能驗證10.3性能確認時機c)核酸提取、文庫制備等方案流程的確定前應通過性能確認。d)數據庫建立和生信分析流程應用前應通過性能確認。數據庫更新以及在原有檢測基因和變異10.4測序平臺的性能確認10.5生物信息分析平臺的性能確認全流程檢測，并結合計算機數據模擬變異的方式10.6分析性能確認對同一批樣本在同一條件下（相同的環(huán)境、操作人員及儀器）應至少進行3次以上檢測，評價重復性精密度；以及不同時間、不同操作人員、不同儀器（相同型號）應至少進行3次以上檢測，評價再現性精密度。重復性精密度和再現性精密度評價各自的重復檢測次數至少3次，可在實驗流程中安排同時至少使用1例樣本進行精密度驗證實驗，評價精密度的指標包括陰陽性在分子檢測領域，最低檢測限是指用該項分子測試技術能夠測到生物樣本中待測靶核酸分子的最質）并進行梯度稀釋和檢測，計算出最低檢測Sequencing-BasedOncologyPanels:AJointConsensusRecommendationoftheAssociationfor范化管理江蘇專家共識》，《實驗室自建腫瘤全景變異檢測性能確認中國專家共識(2024版)》]準等。實驗室負責人或指定人員應監(jiān)控室間比對活11.2室內質量評價為含有一種或多種檢測范圍內基因和變異類型的樣本，用于監(jiān)測檢驗過程是否正常和滿足質控要PCR或者該實驗室正在開展的NGS檢測方法均可。應至少每月進行1次檢測。如發(fā)現環(huán)境內、設備上存在A.1采樣方式和注意事項A.1.1腫瘤組織采集發(fā)癥，且樣本需經固定、石蠟包埋、H&E染色、免疫組化及顯微鏡鏡檢等步驟明確診斷，多個步驟會消A.1.2根據病變的位置和類型的不同，可采用以下幾種采樣方式。A.1.2.1經氣道活檢樣本管腔內超聲引導經支氣管針吸活檢（EBUS-TB獲取樣本量更大。樣本獲取后建議進行快速現d)不與氣道相通肺內病變。尤其肺外周病變，建議選擇影像引導經皮肺活檢，活檢前可行CT、增強CT等檢查，明確病灶有活性部建議行快速現場評價，以評估樣本中腫瘤細胞數量及質量。A.1.2.2經皮壁層胸膜活檢樣本A.1.3支氣管鏡下肺癌組織樣本和細胞學樣本常見的取材方式包括活檢鉗活檢、支氣管刷檢和肺泡灌A.1.3.1活檢鉗活檢A.1.3.2支氣管刷檢以免鉗檢后出血，影響視野，或刷片有較多紅細胞影A.1.3.3肺泡灌洗根據影像學(主要是CT)表現選擇BAL（肺泡灌洗）的操作部位。BAL操作前6周內的高分辨率CT影像是較為理想的參考依據。一般使用20ml或60ml的注射器灌注37℃左右(或室溫)的0.9%無菌氯化鈉溶液由操作者在可視情況下控制，一般以25～100mmHg(1mmHg＝0.133kPa)的負壓為宜。一般情況下，肺中葉或舌葉的BALF回收率約為灌入量的40%～70%，肺下葉或其他肺葉至少為30%以上。用于BALF細胞分類計數的回收液一般需達到10～20ml，最A.1.4快速現場評價（ROSE）b)毛刷標本需以縱向滾移或同心圓式滾涂于玻片。巴氏細胞病理學會指南將細胞學評估結果分為5類：C1示沒A.1.5樣本后續(xù)處理A.1.5.1活檢鉗活檢標本放在小片濾紙上，立即浸入盛有10%中性福爾馬林溶液的小瓶內A.1.5.2支氣管刷檢A.1.5.3肺泡灌洗胞完整性，然后將細胞沉渣重新懸浮于特定的細胞培養(yǎng)液中(MEM＋25mmol/LHEPES或RPMI1640+有效保存。這對于長期保存組織樣本以及后續(xù)的組織學研究和病理學診斷非常重A.2.1腫瘤組織脫鈣含骨或鈣化組織的樣本需用弱酸（如甲酸）或螯合劑（如EDA.2.2腫瘤組織固定固定液應選擇中性福爾馬林緩沖溶液（使用磷酸鹽緩沖溶液PBS配制），體積至少應為待固定組織體積A.2.3腫瘤組織脫水應按照標準作業(yè)程序定期更換脫水機內的脫A.2.4FFPE樣本制作組織碎屑；切片數量應滿足上機要求(≥10張）；檢測前應進行H&E染色評估腫瘤細胞含量，腫瘤含量應達到20%以上，最佳含量為30%以上，腫瘤細胞體積至少達到A.2.5FFPE樣本保存檢測不超過2年為最優(yōu)；白片可短時間室溫或較長時A.2.6FFPE樣本運輸《肺癌小樣本取材相關問題的中國專家共識》；《肺癌小活檢標本病理診斷規(guī)范專家共識》]3.科學數據表明，部分患者不存在明確的基因突變，因此未檢測到基因突變的檢測結果是是完全無用的信息，并不能證明所有的治療方法有效或無效，它能夠證明在本次樣本中不4.檢測報告根據基因突變情況提示用藥相關性，報告不能作為一個完整的診斷報告，不具備醫(yī)囑5.由于不可抗拒因素（包括但不限于病人不良的身體狀況、采血量不達標、采血管破裂、法順利進行，受檢者可能需要配合檢測機構再次取樣（如果因樣本運輸或其他非檢測原因造成的6.受檢者的個人識別信息、健康信息及檢測數據在檢測過程中將按照中國相關法律法規(guī)及政策保護及慎重使用。簽署本知情同意書即表明您同意授權檢測機構將您的樣本及數據在匿名狀態(tài)下*腫瘤類型*臨床分期*外周血：____ml，EDTA抗凝____管，BCT無創(chuàng)____管）：B.2.1送檢樣本必須為10%的中性福爾馬林固定的樣本，建議于離體后30分鐘內被固定（最長不超過1B.2.3檢測用腫瘤細胞含量應≥20%，建議腫集，同時送檢H&E片1張或加送白片1張用于H&E染色后進行腫瘤含量B.2.6若為穿刺組織或腫瘤切面較小，需適當增加送檢白片或蠟卷數量，保證組織樣本抽提獲得的DNB.2.7為保證成功率，請盡可能送檢一年以內的FFPE樣本GB/T42216.3-2022/ISO20166-3:2），[5]NCCNClinicalPracticeGuidelinesin[8]GB/T42216.3-2022/ISO20166-3:[18]中華人民共和國衛(wèi)生部.醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗工作導則（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)[2010]194號）Pathol.2010,220(2):244fromformalin-fixedparaffin-embeddedspecimens.CancerSci.2019,110(4):），experimentalworkflow:upto100-plexmultiplicity.BMCGenomics.2021,22(1):835.ClinicallyRelevantMolecularProfilesinNon-Small-CellLungCancer:ResultsofExperienceon1343Samples.JMolDiagn.2018,2GenomeBiol.2009,10(10):R116.[30]高通量測序技術臨床規(guī)范化應用北京專家共識（第一版腫瘤部分），中華醫(yī)學雜志,[32]UpdatedMolecularTestinAssociationforMolecularPathology.ArchPatholLabMed.2018,142(3):321-346.diagnosis,treatmentand