內(nèi)蒙古白刺葉總黃酮提取工藝優(yōu)化

內(nèi)蒙古白刺葉總黃酮提取工藝優(yōu)化

摘要:采用乙醇分離純化白刺葉中的總黃酮醇苷,反相高效液相色譜法(RP-HPLC)對(duì)內(nèi)蒙古白刺葉提取物中的總黃酮醇苷進(jìn)行分析。RP-HPLC法測(cè)定白刺葉提取物體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇洗脫部分,流動(dòng)相:V(甲醇)∶V(0.4%H3PO4溶液)=60∶40;檢測(cè)波長508nm;結(jié)果表明,乙醇純化白刺葉中的總黃酮醇苷效果良好,純度可達(dá)到18.28%。關(guān)鍵詞:白刺葉；乙醇；總黃酮醇苷內(nèi)蒙古白刺葉（nitrariatangutorumBobr)為漠黎科（zy-gophyllaoeae)白刺屬植物白刺（nitraiiatangutorumBo-br)的葉，據(jù)《本草綱目》中記述，白刺“氣味辛、寒、無毒，主治心絞痛、痛腫潰膿、止痛”[1]。要分布于我國的內(nèi)蒙古沙漠地區(qū)、西北沙漠地區(qū)及華北、東北沿海地區(qū)，張家口壩上、天津、滄州、壽光、東營等地都有野生白刺，資源豐富并且具有一定的藥理作用，是一種理想的天然抗氧化或防腐劑的提取來源，并且可以作為一種營養(yǎng)的保健成分或者是一種天然的抗氧化劑添加于其他食品中?？傸S醇苷為白刺葉中的主要活性成分，本課題將對(duì)其葉片采用乙醇提取法,優(yōu)選白刺葉總黃酮類的提取工藝，為白刺的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論根據(jù)。。本方法簡便，準(zhǔn)確，易于操作。1實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器與試劑WaterS515高效液相泵，WaterS2996DAD檢測(cè)器，WatersEmpower色譜工作站，Waters色譜柱恒溫箱，電子分析天平(梅特勒公司)，DZ^CW-C型電子恒溫水浴鍋(北京化玻醫(yī)療器械公司)，JDG-0.2真空冷凍干燥機(jī)（蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司)，RE52—98真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，不銹鋼電熱蒸餾水器（上海申安醫(yī)療器械廠)。大孔樹脂（中國滄州遠(yuǎn)威化工有限公司)，pH廣泛試紙。甲醇為色譜純，自制蒸餾水，NaOH，HCl,乙醇H3PO4，石油醚均為分析純。槲皮素對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)110081-201205)山奈素(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)110861-2⑴606)，異鼠李素（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)110861-201407)，白刺葉于2018年12月采于內(nèi)蒙古西烏珠穆沁旗。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL,分別置25mL容量瓶中,各加蒸餾水至6.0mL,加5%亞硝酸鈉溶液1mL,混勻,放置6min,加10%硝酸鋁溶液1mL,搖勻,放置6min,加40.00g/L氫氧化鈉溶液10mL,再加蒸餾水至刻度,搖勻,放置15min,以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照,用紫外可見分光光度法在508nm處測(cè)定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2內(nèi)蒙古白刺葉黃酮類化合物的提取工藝白刺葉→恒溫干燥箱40℃烘48h干燥→粉碎→脫脂→醇回流提取→抽濾→濾液(黃酮類化合物溶液)→濃縮→定容→分析測(cè)定總黃酮類的含量。1.3黃酮類化合物樣品測(cè)定方法精確稱量白刺葉提取液1mL。加入蒸餾水5mL;加入5%亞硝酸鈉溶液1mL,搖勻并放置6min;加入5%硝酸鋁溶液1mL,搖勻并放置6min;再加入1mol/L氫氧化鈉溶液10mL;最后用蒸餾水定容至25mL,溶液搖勻放置15min。用可見分光光度計(jì)在508nm波長處測(cè)定吸光度。按上述試驗(yàn)方法和步驟測(cè)其吸光度并按下式計(jì)算白刺葉黃酮類化合物的提取率:提取率(%)=提取液中黃酮類化合物質(zhì)量(g)/白刺葉質(zhì)量(g)[2-3]。1.4白刺葉黃酮類化合物提取的單因素試驗(yàn)方法以白刺葉總黃酮類含量為考察指標(biāo),選擇乙醇濃度、料液比、浸提時(shí)間、浸提溫度作為考察的四個(gè)影響因素,每個(gè)因素設(shè)定5個(gè)梯度,每個(gè)因素的設(shè)定梯度分別為乙醇濃度55%,65%,75%,85%,95%,其他試驗(yàn)條件為料液比為1∶25,浸提溫度為60℃,浸提時(shí)間為2.0h;料液比1∶10,1∶15,1∶20,1∶25,1∶30,其他試驗(yàn)條件為乙醇濃度為85%,浸提溫度為60℃,浸提時(shí)間為2.0h。浸提溫度50℃、60℃、70℃、80℃、90℃,其他試驗(yàn)條件為乙醇濃度為85%,料液比為1∶25,浸提時(shí)間為2.0h;浸提時(shí)間0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h,其他試驗(yàn)條件為乙醇濃度為85%,料液比為1∶25,浸提溫度為60℃[4-5]。1.5白刺葉黃酮類化合物提取的正交試驗(yàn)方法參照單因素試驗(yàn)結(jié)果,采用四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),優(yōu)選白刺葉黃酮類化合物提取的最佳工藝條件。2含量測(cè)定2.1槲皮素，山奈素，異鼠李素混標(biāo)含量測(cè)定的色譜條件KromasilC18色譜柱（4.6mmX250mm,5Mm);流速1.0mL/min;柱溫30°C;流動(dòng)相：F(甲醇）：V(0.4%H3PO4水溶液）=60:40。檢測(cè)波長360nm;見圖1。圖1白刺葉總黃酮醇苷HPLC2.1.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取槲皮素，山奈素，異鼠李素對(duì)照品適量，加甲醇制成槲皮素濃度為0.06mg/mL，山奈素濃度為0.008mgImL和異鼠李素的濃度為0.0027mgliL的混標(biāo)溶液。2.1.2供試品溶液的制備[6-7]將白刺葉總黃酮醇苷提取物準(zhǔn)確稱取89.80mg加入V(甲醇）：V（25%的HCl溶液）=4:1混合液25mL70°C回流30min放冷。轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，加甲醇到刻度，用微孔濾膜（0.45μm)濾過待用。2.1.3線性關(guān)系考察用微量進(jìn)樣器分別準(zhǔn)確吸取槲皮素，山奈素和異鼠李素混標(biāo)溶液5.0，10.0，15.0，20.0，25.0μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以槲皮素，山奈素，異鼠李素混標(biāo)溶液進(jìn)樣體積（L)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[8-9]。結(jié)果表明，槲皮素在0.3~1.5作線性關(guān)系良好，其回歸方程為：y=2992226.38m—1934989.5，r=0.9997。山奈素在0.04~0.2%線性關(guān)系良好。其回歸方程為：y=245431m+38000，r=0.99996。異鼠李素0.0135~0.0675%線性關(guān)系良好。其回歸方程為：y=52834.6m—3834.4，r=0.9995。2.2穩(wěn)定性試驗(yàn)準(zhǔn)確吸取同一供試品溶液5μL，0，2，4，8，12h測(cè)定，槲皮素，山奈素，異鼠李素峰面積積分值RSD分別為0.65%,0.75%,0.98%2.3精密度試驗(yàn)準(zhǔn)確吸取槲皮素，山奈素，異鼠李素混標(biāo)溶10%，分別重復(fù)進(jìn)樣5次。峰面積積分值RSD分別為0.53%，0.53%，0.52%。2.4重復(fù)性試驗(yàn)取同一樣品5份，分別按含量測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄槲皮素，山奈素峰面積積分值，RSD分別為0.96%，0.85%和1.98%。2.5加樣回收率分別取5份的白刺葉總黃酮醇苷提取物稱取適量約0.10g，分別精密加入槲皮素，山奈素，異鼠李素對(duì)照品，照含量測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定，平均回收率分別為97.32%，95.24%，98.10%。RSD分別為0.87%，0.69%，0.85%。2.6計(jì)算方法總黃酮醇苷含量=(槲皮素含量十山奈素含量+異鼠李素含量)X251=18.28%。3討論洗脫過程中，采用體積分?jǐn)?shù)55%,65%,75%,85%,95%的乙醇洗脫，結(jié)果表明，70%洗脫效果較好，方法簡便，且容易回收。目前用大孔樹脂AB-8純化白刺總黃酮醇苷研究尚未見報(bào)道，對(duì)于白刺總黃酮醇苷的藥理活性部位，作用機(jī)理的研究都還處于初步研究階段。鑒于白刺豐富的自然資源，對(duì)白刺葉進(jìn)一步有效合理地開發(fā)利用是十分必要的。參考文獻(xiàn)[1]李巖,劉晶,李田葉,王向紅.白刺葉提取物的抗氧化及抑菌性研究[J].食品工業(yè),2015,36(03):94-98.[2]高喆,王佳,特布沁,王迎春.唐古特白刺葉和莖黃酮含量分析[J].中國草地學(xué)報(bào),2014,36(03):116-120.[3]劉利平.內(nèi)蒙古白刺屬四種植物營養(yǎng)成分分析及其評(píng)價(jià)[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.[4]薩茹麗.沙蔥黃酮提取工藝優(yōu)化、結(jié)構(gòu)鑒定及其相關(guān)生物活性研究[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.[5]孫京沙.大葉藻總黃酮的提取、純化及抗衰老活性的研究[D].中國海洋大學(xué),2014.[6]林志欽.蓮子心總黃酮的提取純化及其功能性研究[D].福建農(nóng)林大學(xué),2012.[7]王宇希.丁香葉總黃酮的提取工藝及抑菌效果評(píng)價(jià)[D].東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.[8]吳金梅.甘草總黃酮抗金黃色葡萄球菌作用及其治療奶牛乳房炎的應(yīng)用研究[D