山羊痘和綿羊痘熒光PCR檢測(cè)方法

Q/LB.□XXXXX-XXXXDB22/TXXXX—XXXX目次TOC\o"1-1"\h1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14縮略語 15試劑材料和儀器設(shè)備 16樣品采集和處理 27操作方法 38結(jié)果判定 4附錄A（規(guī)范性）溶液配制 6附錄B（資料性）引物探針名稱、序列 7附錄C（資料性）熒光PCR反應(yīng)體系 8前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口管理。本文件起草單位：沈陽海關(guān)技術(shù)中心。本文件主要起草人：耿慶華、林森、孟祥勇、啜微微、付洋、韓宏乾。本文件發(fā)布實(shí)施后，任何單位和個(gè)人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進(jìn)行反饋，我們將及時(shí)答復(fù)并認(rèn)真處理，根據(jù)實(shí)際情況依法進(jìn)行評(píng)估及復(fù)審。歸口管理部門通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳（沈陽市和平區(qū)太原北街2號(hào)），聯(lián)系電話文件起草單位通訊地址：沈陽海關(guān)技術(shù)中心（遼寧省沈陽市沈河區(qū)東濱河路106號(hào)），聯(lián)系電話山羊痘和綿羊痘熒光PCR檢測(cè)方法范圍本文件規(guī)定了山羊痘和綿羊痘熒光PCR檢測(cè)的操作方法。本文件適用于山羊痘和綿羊痘病毒的檢測(cè)及其流行病學(xué)調(diào)查、診斷、檢疫和監(jiān)測(cè)。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T576綿羊痘和山羊痘診斷技術(shù)NY/T541獸醫(yī)診斷樣品的采集、保存和運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義?？s略語下列縮略語適用于本文件。DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）GTPV：山羊痘病毒（goatpoxvirus）SPPV：綿羊痘病毒（sheeppoxvirus）試劑材料和儀器設(shè)備試劑材料DNAzol，商品化DNA抽提試劑，于4℃～8℃保存。無水乙醇，-20℃預(yù)冷。75%乙醇，無水乙醇和雙蒸水配制，-20℃預(yù)冷。8mMNaOH溶液，配制見附錄A。PBS緩沖液，0.01mol/LPBS，pH7.4，配制見附錄A。Taq酶及10倍Taq酶反應(yīng)緩沖液：Taq酶濃度為5U/μL，Taq酶反應(yīng)緩沖液中Mg2+濃度為15mM。dNTPs：含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mmol/L，-20℃保存，避免反復(fù)凍融。引物和TaqMan探針，其序列見附錄B。1.5mLEppendorf管。0.2mLPCR薄壁管或八聯(lián)管。山羊痘和綿羊痘病毒陽性對(duì)照樣品：采用商品化山羊痘或綿羊痘病毒疫苗或接種了山羊痘和綿羊痘病毒的細(xì)胞懸液。山羊痘和綿羊痘病毒陰性對(duì)照樣品：采用MDBK（牛腎細(xì)胞）細(xì)胞懸液或健康羊肉組織。儀器設(shè)備熒光PCR檢測(cè)儀：ABI7500或功能相似的熒光PCR檢測(cè)儀。高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：可控溫至4℃、離心速度可達(dá)12000r/min以上。組織研磨器或者研缽。普通冰箱。超低溫冰箱：可控溫至?70℃。微量移液器：0.2μL～2μL，1μL～10μL，10μL～100μL，20μL～200μL，100μL～1000μL，并配備與移液器匹配的吸頭。高壓滅菌鍋。樣品采集和處理采樣工具手術(shù)刀、剪刀、鑷子，經(jīng)160℃干熱滅菌2h。一次性無菌采樣拭子。組織研磨器或者研缽，經(jīng)160℃干熱滅菌2h。真空采血管。記號(hào)筆。低溫保藏箱。樣品采集血清樣本采集：用無菌注射器抽取受檢山羊或綿羊靜脈血不少于5mL，置于無菌離心管內(nèi)，室溫或者37℃傾斜放置自然凝集20min～30min，2000r/min～3000r/min離心10min，吸取上清液200μL到新的離心管內(nèi)備用。精液樣品采集：按照NY/T541的方法采集和保存精液。鼻拭子采集：用棉拭子取受檢羊鼻腔分泌物，置于2mLPBS緩沖液中備用。組織樣本采集：取活體或剖檢羊的皮膚丘疹用于病毒分離和抗原檢測(cè)。細(xì)胞培養(yǎng)物：待出現(xiàn)80%以上細(xì)胞病變時(shí)，將整瓶細(xì)胞凍在?80℃?zhèn)溆?。樣本送檢上述采集的樣本可立即用于檢測(cè)，樣本在2℃～8℃下保存應(yīng)不超過24h，?20℃±5℃可以穩(wěn)定保存3個(gè)月，長期保存請(qǐng)置于?70℃以下。樣本運(yùn)送采用低溫保藏箱或泡沫箱加生物冰袋密封進(jìn)行運(yùn)輸。樣本處理血清和精液樣本無需進(jìn)行前處理，直接用于核酸提取。鼻拭子樣本：充分渦旋震蕩含有鼻拭子的管子1min～3min，2000r/min離心5min，取出200μL上清，用于后續(xù)的核酸提取。組織樣本：取1g解凍的組織，剪碎，加入2mLPBS緩沖液進(jìn)行研磨，制備組織勻漿，8000r/min離心5min，取上清200μL，用于后續(xù)的核酸提取。細(xì)胞培養(yǎng)物：將細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，解凍期間，間隔5min，搖晃十下細(xì)胞培養(yǎng)瓶，第3次解凍后，將細(xì)胞培養(yǎng)物置于滅菌離心管內(nèi)，4000r/min，4℃離心10min，取上清200μL，用于后續(xù)的核酸提取。操作方法實(shí)驗(yàn)室要求山羊痘和綿羊痘病毒熒光PCR檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室分為三個(gè)相對(duì)獨(dú)立的工作區(qū)域：核酸提取區(qū)、試劑配制區(qū)和檢測(cè)區(qū)。工作區(qū)域間應(yīng)有明確的標(biāo)識(shí)，每一個(gè)區(qū)域應(yīng)有專用的儀器設(shè)備，避免不同區(qū)域的設(shè)備、物品共用。DNA抽提DNA抽提使用DNAzol手工提取，也可以使用等效的商品化試劑盒提取，在核酸提取區(qū)操作。取n個(gè)滅菌的1.5mL離心管，其中n為待檢樣品數(shù)+陽性對(duì)照+陰性對(duì)照，對(duì)每個(gè)離心管進(jìn)行編號(hào)。每管加入800μLDNAzol，分別加入被檢樣品、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照各200μL，顛倒10次混勻，4℃或室溫10000r/min離心10min。取900μL上清，置于新的1.5mL滅菌離心管中，加入500μL無水乙醇，混勻，室溫放置3min；4℃或室溫10000r/min離心5min。棄上清，沿管壁緩緩加入0.8mL～1mL75%乙醇，顛倒3次～6次混勻，4℃10000r/min離心5min。反復(fù)洗滌兩次后，將離心管倒扣于吸水紙上，自然晾干或用移液器移去殘液。用30μL8mMNaOH溶液溶解沉淀，DNA在4℃冰箱可穩(wěn)定保存數(shù)月，?20℃冰箱可長期保存。熒光PCR檢測(cè)反應(yīng)體系的配制在試劑配制區(qū)進(jìn)行。設(shè)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)管數(shù)為n，n為待檢樣品數(shù)+陽性管數(shù)+陰性管數(shù)，每個(gè)反應(yīng)的體系見附錄C，為了避免移液器取樣損失，建議按n+1個(gè)反應(yīng)進(jìn)行配制。配制反應(yīng)液在冰盒中進(jìn)行。反應(yīng)液的分裝將6.3.1中配制的熒光PCR反應(yīng)液充分混勻，按照每管38.8μL分裝于0.2mL透明PCR管內(nèi)，將PCR管置于96孔板上，按順序加樣并做好標(biāo)識(shí)，轉(zhuǎn)移至核酸提取區(qū)。加樣在核酸提取區(qū)進(jìn)行。在每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)加入5μLDNA模板，并分別加入本文件中7.2制備的核酸10μLDNA溶液，蓋上蓋子，500r/min～1000r/mi離心30sec。轉(zhuǎn)移至檢測(cè)區(qū)。上機(jī)檢測(cè)在檢測(cè)區(qū)進(jìn)行。將6.3.3中離心后的PCR管放入熒光PCR檢測(cè)儀內(nèi)，設(shè)置探針：5’選擇FAM熒光通道，3’選擇MGB熒光通道。循環(huán)條件設(shè)置第一階段，預(yù)反應(yīng)50℃/2min；第二階段，酶活化95℃/2min；第三階段，變性95℃/15sec，退火、延伸、熒光采集60℃20sec，45個(gè)循環(huán)；第四階段，冷卻25℃/10sec。檢測(cè)結(jié)束后，保存結(jié)果，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。結(jié)果判定閾值設(shè)定閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴(kuò)增的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。質(zhì)量控制陰性對(duì)照：無Ct值或無典型的S型擴(kuò)增曲線。陽性對(duì)照：Ct值≤30，且擴(kuò)增曲線為典型的S型。以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行。結(jié)果描述及判定被檢樣品檢測(cè)結(jié)果中Ct值≤36，且有典型的S形擴(kuò)增曲線，報(bào)告為GTPV或SPPV陽性；被檢樣品檢測(cè)結(jié)果無Ct值或無典型的S型擴(kuò)增曲線，報(bào)告為GTPV或SPPV陰性。被檢樣品檢測(cè)結(jié)果中36＜Ct值≤40，且有擴(kuò)增曲線，報(bào)告為GTPV或SPPV疑似；需要進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。GTPV或SPPV疑似樣品需要進(jìn)行三平行實(shí)驗(yàn)，如果重復(fù)實(shí)驗(yàn)有兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果仍為疑似，則最終檢測(cè)結(jié)果報(bào)告為GTPV或SPPV陽性，否則判定為陰性。

（規(guī)范性）

溶液配制8mMNaOH溶液稱量0.32gNaOH，溶解到1000mL去離子水中，混勻，分裝，常溫保存。磷酸鹽緩沖液（0.01mol/LPBS，pH7.4）用800mL蒸餾水溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4。用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加水至1L。分裝后經(jīng)121℃、15min高壓滅菌后備用。

（資料性）

引物探針名稱、序列引物探針名稱、序列見表B.1。引物探針名稱、序列名稱序列P1（上游引物）5′-CAGGAGGTGTTGAAAATTTTACAG-3′P2（下游引物）5′-CCGCATCGGCATACGATTTCC-3′P3（探針）5′-(FAM)-ACAAAGAGCATTACATAAT-(MGB)-3′引物和探針可由生物公司合成，用TE溶液溶解并稀釋至100