《醫(yī)療器械生物學評價+第5部分：體外細胞毒性試驗GBT+16886.5-2017》詳細解讀

《醫(yī)療器械生物學評價第5部分：體外細胞毒性試驗GB/T16886.5-2017》詳細解讀contents目錄1范圍2規(guī)范性引用文件3術(shù)語和定義4樣品和對照品制備5細胞系6培養(yǎng)基7貯存培養(yǎng)細胞制備8試驗步驟contents目錄9試驗報告10結(jié)果評定附錄A(資料性附錄)中性紅攝取(NRU)細胞毒性試驗性附錄B(資料性附錄)集落形成細胞毒性試驗附錄C(資料性附錄)MTT細胞毒性試驗附錄D(資料性附錄)XTT細胞毒性試驗參考文獻011范圍醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)該標準為醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品設(shè)計和生產(chǎn)過程中進行體外細胞毒性試驗提供了指導和規(guī)范。檢測機構(gòu)對于負責醫(yī)療器械安全性和有效性評估的檢測機構(gòu)，該標準提供了體外細胞毒性試驗的具體方法和評估準則。適用對象安全性評價通過體外細胞毒性試驗，對醫(yī)療器械的安全性進行評價，確保其在使用過程中不會對人體細胞產(chǎn)生毒性作用。試驗方法標準詳細闡述了體外細胞毒性試驗的具體方法，包括細胞培養(yǎng)、樣品制備、試驗操作等步驟。評估準則提供了對試驗結(jié)果進行解讀和評估的準則，幫助企業(yè)和檢測機構(gòu)判斷醫(yī)療器械的細胞毒性情況。涵蓋內(nèi)容022規(guī)范性引用文件GB/T16886.1-2011醫(yī)療器械生物學評價第1部分：風險管理過程中的評價與試驗YY/T0466.1-2009醫(yī)療器械用于醫(yī)療器械標簽、標記和提供信息的符號第1部分：通用要求GB15810-2001一次性使用無菌注射器醫(yī)療器械相關(guān)標準GB/T14233.2-2005醫(yī)用有機硅材料生物學評價試驗方法GB/T16175-1996ISO10993-52009：醫(yī)療器械的生物學評價第5部分：體外細胞毒性試驗（Biologicalevaluationofmedicaldevices-Part5:Testsforinvitrocytotoxicity）醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第2部分：生物學試驗方法試驗方法相關(guān)標準GB/Z21720-2008細胞毒性試驗質(zhì)量控制指南WS/T316-2009醫(yī)療器械風險管理對醫(yī)療器械的應用細胞培養(yǎng)與毒性評價相關(guān)標準033術(shù)語和定義醫(yī)療器械是指用于預防、診斷、治療、緩解人類疾病、損傷或殘疾的設(shè)備、器具、器材、材料或其他物品。醫(yī)療器械定義根據(jù)其用途和特性，醫(yī)療器械可分為多種類別，如手術(shù)器械、診斷設(shè)備、植入物、體外診斷試劑等。分類與用途3.1醫(yī)療器械生物學評價意義通過對醫(yī)療器械進行生物學評價，可評估其與人體接觸后可能產(chǎn)生的生物相容性反應，確保醫(yī)療器械的安全性和有效性。評價內(nèi)容與方法生物學評價包括細胞毒性試驗、致敏試驗、刺激與遲發(fā)型超敏反應試驗等多個方面，采用體內(nèi)外試驗相結(jié)合的方法進行。3.2生物學評價3.3體外細胞毒性試驗試驗方法常用的體外細胞毒性試驗方法包括細胞增殖度法、細胞形態(tài)觀察法、細胞毒性分級法等。這些方法可單獨或聯(lián)合使用，以更全面地評估醫(yī)療器械的細胞毒性。試驗原理體外細胞毒性試驗是通過將醫(yī)療器械材料或其浸提液與細胞接觸，觀察細胞生長、增殖及形態(tài)變化等指標，以評價材料的細胞毒性。浸提液指將醫(yī)療器械材料按一定比例與溶劑混合后，通過一定時間和條件浸提得到的液體。浸提液用于模擬醫(yī)療器械與人體接觸時可能釋放出的物質(zhì)。細胞毒性3.4相關(guān)術(shù)語解釋指醫(yī)療器械材料或其浸提液對細胞生長、增殖和功能產(chǎn)生的不良影響。細胞毒性是評價醫(yī)療器械生物相容性的重要指標之一。0102044樣品和對照品制備樣品來源應明確樣品的來源，包括醫(yī)療器械材料、加工過程中的中間產(chǎn)物或最終產(chǎn)品等。樣品處理樣品形狀和尺寸4.1樣品制備根據(jù)試驗需求，對樣品進行適當?shù)奶幚?，如清洗、消毒、干燥、切割等，確保樣品符合試驗要求。根據(jù)試驗方法和細胞類型，選擇適當?shù)臉悠沸螤詈统叽?，以便與細胞充分接觸并便于觀察。應選擇與試驗樣品相同或相似的材料作為陰性對照，以排除非特異性反應的影響。陰性對照根據(jù)需要，選擇已知具有細胞毒性的物質(zhì)作為陽性對照，以驗證試驗方法的敏感性和可靠性。陽性對照對照品應與試驗樣品進行相同的處理，以確保試驗條件的一致性。對照品處理4.2對照品制備為確保試驗過程中樣品和對照品的可追溯性，應采用適當?shù)臉俗R方法對它們進行標記。標識方法應詳細記錄樣品和對照品的來源、處理過程、形狀、尺寸等信息，以便后續(xù)數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解釋。記錄要求4.3樣品和對照品的標識與記錄儲存條件根據(jù)樣品和對照品的性質(zhì)，選擇適當?shù)膬Υ鏃l件，如溫度、濕度、光照等，以確保其穩(wěn)定性和有效性。運輸要求在運輸過程中，應采取必要的措施防止樣品和對照品受到污染、損壞或變質(zhì)。4.4樣品和對照品的儲存與運055細胞系從動物或人體組織直接分離得到的細胞，如成纖維細胞、上皮細胞等。原代細胞傳代細胞轉(zhuǎn)化細胞系經(jīng)過傳代培養(yǎng)后的細胞，如人胚肺細胞、小鼠成纖維細胞等。經(jīng)特定方法轉(zhuǎn)化后的細胞，如SV40轉(zhuǎn)染的細胞系。5.1適用的細胞系選擇的細胞系應與醫(yī)療器械接觸的組織類型相關(guān)。相關(guān)性原則選擇的細胞系應對試驗物質(zhì)敏感，能反映出潛在的細胞毒性。敏感性原則選擇的細胞系應具有良好的穩(wěn)定性和一致性，以保證試驗結(jié)果的可靠性。穩(wěn)定性原則5.2細胞系的選擇原則010203按照細胞培養(yǎng)的標準操作流程進行細胞的復蘇、傳代和凍存。細胞復蘇與培養(yǎng)采用適當?shù)募毎嫈?shù)方法和活性檢測試劑，確保試驗用的細胞數(shù)量和質(zhì)量。細胞計數(shù)與活性檢測根據(jù)細胞系的特性，調(diào)整培養(yǎng)基成分、pH值、溫度等條件，以保證細胞的最佳生長狀態(tài)。培養(yǎng)條件優(yōu)化5.3細胞系的準備與培養(yǎng)01細胞污染防控嚴格遵循無菌操作規(guī)范，防止細菌、真菌等微生物的污染。5.4注意事項02細胞狀態(tài)監(jiān)控定期對細胞進行形態(tài)學觀察和生長曲線測定，確保細胞處于良好的生長狀態(tài)。03數(shù)據(jù)記錄與分析詳細記錄試驗過程中的各項數(shù)據(jù)，包括細胞數(shù)量、活性、形態(tài)等，以便進行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解讀。066培養(yǎng)基選擇適合試驗細胞生長和維持的培養(yǎng)基，確保細胞在培養(yǎng)過程中能夠獲得必要的營養(yǎng)物質(zhì)。適用性在試驗過程中，應使用相同類型和批次的培養(yǎng)基，以保持試驗條件的一致性。一致性6.1培養(yǎng)基的選擇根據(jù)細胞類型和試驗需求，確定培養(yǎng)基的成分和配比，包括氨基酸、維生素、無機鹽等。成分與配比在制備培養(yǎng)基時，應嚴格遵守無菌操作規(guī)程，避免微生物污染。無菌操作6.2培養(yǎng)基的制備定期檢查培養(yǎng)基的pH值，確保其適合細胞生長。pH值維持適當?shù)臐B透壓，以保證細胞的正常生理功能。滲透壓對制備好的培養(yǎng)基進行無菌性檢查，確保無微生物污染。無菌性檢查6.3培養(yǎng)基的質(zhì)量控制VS遵循培養(yǎng)基的使用說明，正確添加和使用培養(yǎng)基。儲存條件將培養(yǎng)基儲存在適當?shù)臏囟群蜐穸葪l件下，避免受潮和變質(zhì)。使用方法6.4培養(yǎng)基的使用與儲存077貯存培養(yǎng)細胞制備7.1細胞株的選擇推薦人二倍體細胞株、小鼠成纖維細胞株等。原則選擇已建立穩(wěn)定傳代且生物學特性明確的細胞株。適宜細胞生長和維持的培養(yǎng)基，如DMEM、RPMI1640等。培養(yǎng)基一般控制在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。溫度與濕度7.2細胞培養(yǎng)條件傳代根據(jù)細胞生長速度和密度，及時進行傳代操作，以保持細胞活力。凍存采用適宜的凍存液（如含10%DMSO的FBS），在-80℃或液氮中長期保存細胞。7.3細胞傳代與凍存7.4細胞復蘇與培養(yǎng)定期檢查細胞生長狀態(tài)，及時更換培養(yǎng)基并進行必要的處理。培養(yǎng)從凍存狀態(tài)中取出細胞，迅速解凍并轉(zhuǎn)移到預熱的培養(yǎng)基中。復蘇088試驗步驟細胞株選擇根據(jù)試驗需求，選擇適當?shù)募毎辏鏛929小鼠成纖維細胞等。細胞培養(yǎng)按照細胞培養(yǎng)標準操作規(guī)程進行細胞復蘇、傳代和培養(yǎng)。試劑與材料準備準備所需試劑，如培養(yǎng)基、血清、胰酶等，以及試驗用醫(yī)療器械包裝材料樣品。8.1試驗準備8.2試驗操作樣品處理將醫(yī)療器械包裝材料樣品按照規(guī)定的方法進行提取或浸提，獲得試驗用浸提液。細胞接種將處于對數(shù)生長期的細胞接種于適當?shù)呐囵B(yǎng)容器中，如96孔板。浸提液添加向接種有細胞的培養(yǎng)容器中加入規(guī)定量的浸提液，同時設(shè)立陰性對照和陽性對照。細胞培養(yǎng)與觀察將培養(yǎng)容器置于適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，并定期觀察細胞形態(tài)和生長情況。細胞毒性評價根據(jù)細胞形態(tài)變化、細胞增殖抑制率等指標評價醫(yī)療器械包裝材料的細胞毒性。018.3結(jié)果評價結(jié)果判定按照相關(guān)標準或規(guī)定對試驗結(jié)果進行判定，如細胞毒性分級等。02試驗數(shù)據(jù)記錄詳細記錄試驗過程中的各項數(shù)據(jù)，包括細胞接種數(shù)量、浸提液添加量、觀察時間等。結(jié)果分析與討論對試驗結(jié)果進行深入分析和討論，探討可能的影響因素及改進措施。試驗結(jié)論根據(jù)試驗結(jié)果和評價，得出醫(yī)療器械包裝材料體外細胞毒性試驗的結(jié)論。8.4試驗報告099試驗報告9.1報告內(nèi)容試驗原理說明體外細胞毒性試驗的基本原理和方法，包括細胞培養(yǎng)、樣品制備、暴露時間等。材料與方法結(jié)果與討論詳細描述試驗過程中使用的材料、設(shè)備和方法，包括細胞系的選擇、培養(yǎng)條件、樣品的處理和暴露方式等。提供細胞毒性試驗結(jié)果，包括細胞形態(tài)學觀察、細胞增殖和細胞毒性等方面的數(shù)據(jù)，并對結(jié)果進行解釋和討論。附錄提供相關(guān)數(shù)據(jù)和圖表，以便讀者更深入地了解試驗結(jié)果。摘要簡要概括試驗的目的、方法、結(jié)果和結(jié)論，方便讀者快速了解報告核心內(nèi)容。結(jié)論與建議根據(jù)試驗結(jié)果，給出明確的結(jié)論和可能的改進建議。正文按照上述“9.1報告內(nèi)容”中的要點，詳細撰寫試驗報告。標題頁包括試驗報告的名稱、試驗日期、試驗人員等信息。9.2報告格式9.3報告審核與簽發(fā)審核流程試驗報告應經(jīng)過試驗人員、項目負責人和質(zhì)量保證部門的審核，確保報告的準確性和完整性。簽發(fā)與存檔審核通過的試驗報告應由相關(guān)負責人簽發(fā)，并加蓋單位公章。同時，報告應進行存檔備查。9.4注意事項010203保密性由于醫(yī)療器械的生物學評價涉及商業(yè)機密，試驗報告應注意保密，避免泄露相關(guān)信息。法規(guī)符合性試驗報告應符合相關(guān)法規(guī)和標準的要求，以確保醫(yī)療器械的安全性和有效性。持續(xù)改進針對試驗中發(fā)現(xiàn)的問題，應持續(xù)改進試驗方法和技術(shù)，提高評價的準確性和可靠性。1010結(jié)果評定細胞形態(tài)學觀察通過顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化，評估醫(yī)療器械對細胞是否有毒性作用。細胞相對增殖率通過計算細胞相對增殖率，判斷醫(yī)療器械對細胞生長的影響。評定標準評定流程試驗前準備確保試驗器械無菌，準備好所需的試劑和設(shè)備，設(shè)置好對照組和實驗組。按照標準規(guī)定的方法進行細胞接種、器械浸提液制備、細胞暴露等操作。試驗操作在規(guī)定的時間點觀察并記錄細胞的形態(tài)學變化和增殖情況。結(jié)果觀察與記錄無毒性如果細胞形態(tài)正常，相對增殖率≥100%，則認為醫(yī)療器械無細胞毒性。輕度毒性如果細胞形態(tài)輕微變化，相對增殖率在75%~99%之間，則認為醫(yī)療器械有輕度細胞毒性。中度毒性如果細胞形態(tài)明顯變化，相對增殖率在50%~74%之間，則認為醫(yī)療器械有中度細胞毒性。重度毒性如果細胞形態(tài)嚴重變化，相對增殖率＜50%，則認為醫(yī)療器械有重度細胞毒性。結(jié)果解釋試驗過程中要確保無菌操作，避免污染對結(jié)果的影響。注意事項要嚴格按照標準規(guī)定的方法進行試驗，確保結(jié)果的準確性和可靠性。在結(jié)果評定時要綜合考慮細胞形態(tài)學觀察和相對增殖率兩個指標，避免單一指標的片面性。11附錄A(資料性附錄)中性紅攝取(NRU)細胞毒性試驗性細胞毒性評價通過檢測細胞對中性紅的攝取能力，評估醫(yī)療器械材料對細胞的潛在毒性作用。中性紅特性中性紅是一種活細胞染料，可被正常細胞攝取并積聚在溶酶體內(nèi)，其攝取量可反映細胞的活力和數(shù)量。試驗原理根據(jù)試驗需求，準備相應的醫(yī)療器械材料樣本。醫(yī)療器械材料選擇高質(zhì)量的中性紅染料，確保試驗結(jié)果的準確性。中性紅染料01020304選擇適宜的細胞系進行試驗，如小鼠成纖維細胞(L929)等。細胞系包括細胞培養(yǎng)基、顯微鏡、分光光度計等必要的試劑和設(shè)備。其他試劑與設(shè)備試驗材料結(jié)果分析根據(jù)細胞對中性紅的攝取量，判斷醫(yī)療器械材料的細胞毒性程度?？稍O(shè)定不同的毒性分級標準，如無毒、輕度毒性、中度毒性和重度毒性等。細胞培養(yǎng)將選定的細胞系接種于適宜的培養(yǎng)基中，進行預培養(yǎng)。材料處理將醫(yī)療器械材料樣本進行處理，如制備浸提液或直接與細胞接觸。中性紅攝取試驗向細胞培養(yǎng)物中加入中性紅染料，繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后，觀察并測定細胞對中性紅的攝取情況。試驗方法試驗過程中應嚴格遵守無菌操作規(guī)范，避免微生物污染對試驗結(jié)果的影響。合理設(shè)置試驗對照組，以便準確評估醫(yī)療器械材料的細胞毒性作用。選擇適宜的細胞系和醫(yī)療器械材料樣本，確保試驗結(jié)果的代表性和可靠性。根據(jù)實際情況調(diào)整試驗參數(shù)和條件，以獲得更為準確和全面的評價結(jié)果。注意事項12附錄B(資料性附錄)集落形成細胞毒性試驗試驗原理觀察細胞在受試材料作用下的增殖與分化情況，以判斷材料的生物相容性。細胞增殖與分化通過檢測細胞集落的形成能力來評估醫(yī)療器械包裝材料的細胞毒性。集落形成細胞毒性試驗將細胞接種在受試材料表面，進行培養(yǎng)并觀察細胞生長情況。細胞接種與培養(yǎng)試驗步驟在培養(yǎng)一定時間后，觀察并記錄細胞集落的數(shù)量、大小和形態(tài)。集落形成觀察對觀察到的集落進行統(tǒng)計分析，評估受試材料的細胞毒性。數(shù)據(jù)分析結(jié)果解讀無毒性反應若細胞在受試材料表面正常增殖并形成集落，說明材料無明顯的細胞毒性。輕度毒性反應若細胞增殖受到一定抑制，但仍能形成一定數(shù)量的集落，說明材料可能具有一定的細胞毒性，但毒性較低。重度毒性反應若細胞增殖受到嚴重抑制，無法形成集落或集落數(shù)量極少，說明材料具有明顯的細胞毒性。選擇適當?shù)募毎愋瓦M行試驗，以更好地模擬實際使用情況下的生物相容性。細胞選擇為確保結(jié)果的可靠性，建議進行多次重復試驗并取平均值進行數(shù)據(jù)分析。重復試驗確保試驗過程中的溫度、濕度、pH值等條件符合標準要求，以保證試驗結(jié)果的準確性。試驗條件控制注意事項13附錄C(資料性附錄)MTT細胞毒性試驗MTT法原理MTT是一種黃顏色的染料，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。細胞毒性評價試驗原理通過測定細胞代謝活性的變化，可反映材料對細胞造成的毒性損害程度。0102提取液與細胞共培養(yǎng)：將不同濃度的提取液加入細胞培養(yǎng)體系中，與細胞共培養(yǎng)一定時間。細胞接種與培養(yǎng)：將試驗細胞接種到適當?shù)呐囵B(yǎng)容器中，加入培養(yǎng)基進行預培養(yǎng)。結(jié)晶溶解與吸光度測定：去除上清液，加入DMSO等溶劑溶解甲瓚結(jié)晶，通過酶標儀測定各孔吸光度值。醫(yī)療器械材料提取液制備：按照相關(guān)標準制備醫(yī)療器械材料的提取液。MTT溶液加入與孵育：培養(yǎng)結(jié)束后，加入MTT溶液并繼續(xù)孵育一定時間。試驗步驟細胞存活率計算根據(jù)吸光度值計算細胞存活率，以評價醫(yī)療器械材料的細胞毒性。毒性分級與評價根據(jù)細胞存活率對醫(yī)療器械材料的毒性進行分級評價，如無毒、輕度毒性、中度毒性和重度毒性等。結(jié)果分析與評價試驗條件控制為確保試驗結(jié)果的準確性和可靠性，應嚴格控制試驗條件，如細胞種類、接種密度、培養(yǎng)時間等。MTT法局限性MTT法雖然具有操作簡便、靈敏度高等優(yōu)點，但也存在一定的局限性，如不能區(qū)分細胞死亡類型、易受多種因素影響等。因此，在實際應用中需結(jié)合其他評價方法進行綜合評估。注意事項與局限性14附錄D(資料性附錄)XTT細胞毒性試驗XTT試驗原理XTT（2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide）是一種四唑鹽，可被活細胞線粒體中的脫