T-CVMA 156-2024 豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬丁型冠狀病毒的三重實時熒光RT-PCR檢測方法

T/CVMA156—2024豬丁型冠狀病毒的三重實時熒光RT-PCR檢測方法Atriplereal-timeRT-PCRmethodfordetectionofporcinediarrheavirus,porcinetransmissiblegastroenteritisvirus,andporcinedeltacoronavirus2024-5-8發(fā)布2024-5-8實施中國獸醫(yī)協(xié)會發(fā)布I1豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和檢測方法的試劑和材料、儀器設備、樣品的采集與處理、操作方2規(guī)范性引用文件NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范4符號和縮略語reaction）BHQ：無熒光淬滅基團（Blackholequencher）Ct值：每個反應管內(nèi)的熒光信號量達到設定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（CyMGB：小溝結合物（MinorgroovebindePEDV：豬流行性腹瀉病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus）2RNA：核糖核苷酸（Ribonucleicacid）TGEV：豬傳染性胃腸炎病毒（Tran5試劑和耗材5.1試劑）：5.1.7商品化熒光RT-PCR試劑盒：含一步法熒光R5.1.8陽性對照：重組質(zhì)粒，制備過程見附錄三重熒光RT-PCR擴增用上、下游引物和探針序列見附6儀器與設備6.5冰箱，儲藏溫度在2℃~8℃和?20℃以下。3采集充血、出血、腸壁變薄、含多量水樣糞便等病變明顯的小腸組織。用無菌剪刀剪取約0.5cm酸。如在2h內(nèi)檢測可將提取的核酸置于冰上保存，超過2h對應的樣品編號。蓋緊管蓋后，500g離心30三個熒光通道，F(xiàn)AM對應淬滅基團選擇MGB，其余均選擇無（None）熒光。在熒光PCR儀上進行9結果判定49.1結果分析條件設定9.2試驗成立的條件>40，且無特異性擴增曲線，Cy5通道無Ct值或Ct值＞40，且無特異性擴增曲線。9.2.39.2.1和9.2.2要求需在同一次試驗中同時滿足，否則，本次試驗無效，需重新進行。9.3結果描述及判定若被檢樣品在相應通道Ct值≤38且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判為相應病原核酸陽性。FAM通道光信號表示PDCoV核酸陽性。只有一種陽性熒光信號為單陽性；兩種陽性熒光信號表示對應的其中9.3.3可疑重復試驗結果Ct值≤40且有明顯擴增曲線則判為相應病原核酸陽性，否則判為相應病原核5溶液配制A.1DEPC水），A.20.01mol/LPBA.3拭子懸液），A.4組織懸液6ATGCGCCGTGGTGAGCGAATTGAACAACCTTCCAATTGGCATTTCTACTACCTCGGAACAGGACCTCACGCCGAGAGTAGACTCCTTGCAGGGATTATGGATCCAATGGGTACATGGAGGTGCATTCCCATCGACCACATGGCTCCAATTCTCACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCCAATTTTAATTCTGCTGAAGGTGCTATTATATGCATTTGCAAGGGCTCACCACCTACTACCACCACAGAATCTAGTTTGACTTGCAATTGGGGTAGTGAGTGCAGGTTAAACCATAAGTTCCCTATATGTCCTTCTAATTCAGAGGCAAATTGTGGTAATATGCTGGenBankAccessionNo.KU981059.1為TGEV陽性序列（JS2012株，GenBankAccessionNo.K利用超微量分光光度計測定陽性重組質(zhì)粒濃度，并按下面公式將濃度換算成拷貝數(shù)，DNA拷貝/μL=[6.02×1023×DNA濃度(ng/μL)×10-9]/(DNA堿基數(shù)×660)。作為陽性對照時，選取濃度為104拷貝/μL。7N基因FAM-AACCTTCCAATTGGC-MGBTCTGCTGAAGGTGCTATTATGEV-RHEX-YAAGGGCTCACCACCTACTACCACCA-BHQ1PDCoV-FPDCoV-RPDCoV-PCy5-AATGCACCTCCATGTACC-BHQ2注：簡并堿基Y代表C/T，引物和探針可由生物公司合成，純度為HPLC