SCT 7221-2016 蛙病毒病檢測方法

Il下游引物R1:5'-AAA-GAC-CCG-TTT-TGC-AGC-A2病毒屬(Ranavirus)中除流行性造血器官環(huán)死病毒(Epizooticbepatopoieticnedrosisvirus,EHNV)和歐洲鯽病毒(EuropeancGnshvirus,ECV外的其他成員。蛙病毒是大型的雙鏈DNA病毒，病毒粒子直徑150nm～170nm,二十面體對稱，雙鏈D應(yīng)在10℃以下將樣品勻漿，用M199培養(yǎng)液按1:10的最終稀釋度重懸于含有1000IU/mL青霉素和1000μg/mL鏈霉素的培養(yǎng)液中(見附錄A.2)。15℃下孵育2h～4h或4℃下孵育過夜。8000r/min離心20min,收集上清液。24h的96孔板里的FHM、EPC、CHSE或BF-2細(xì)胞單層中，每孔接種100μL稀釋液。22℃吸附1h后，加入細(xì)胞維持液，于22℃~25℃培養(yǎng)。分別設(shè)置2孔陽性對照(接種參考株)和空白對照(未接種病對照和待測樣品接種細(xì)胞7d內(nèi)，每天用倒置顯微鏡檢查?？瞻讓φ占?xì)胞應(yīng)生長正常。被檢樣品細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)CPE時(shí)，應(yīng)立即進(jìn)行鑒定；如果只有陽性對照出現(xiàn)CPE,被檢樣品細(xì)胞培養(yǎng)中未出現(xiàn)8.1樣品處理3收集出現(xiàn)CPE的細(xì)胞病變懸液450μL,加入1.5mL的離心管，再加入450μLCTAB溶液(見A.3)并混勻。25℃處理2h～2.5h。8.2DNA抽提在含有樣品的離心管中加入600μL抽提液2(見A.5),混合均勻至少30s。12000r/min離心5min,取上層水相(約800μL)置于新的1.5mL離心管中。再加入700μL抽提液1(見A.4),混合至少30s。12000r/min離心5min,取上層水相(約600μL)置于新的1.5mL離心管中。再加入-20℃預(yù)冷的1.5倍體積的無水乙醇(約900μL),倒置數(shù)次混勻后，-20℃沉淀核酸8h以上。12000r/min離心30min,小心棄去上清液。干燥后加1lμL水溶解，用做PCR模板?；虿捎猛裙πУ某樘嵩噭┖?。依次加入以下試劑：模板10o10倍Fq用濃縮緩沖液9μL,25mmoL/L的MgCl?9pL,dNTP2μL,上游引物和下游引物各YμL,Taq酶5U,加水到總體積為100pL。如果使用的PCR擴(kuò)增儀沒有熱蓋，每管還需加入50u,礦物油。短時(shí)間低速離心計(jì)試劑集中在底部，再將反應(yīng)管置于PCR擴(kuò)增儀上，94℃預(yù)變性4min;95℃變性1min、55℃退8.4設(shè)立對照在7.2樣品處理過程中必須設(shè)立陽性對照、陰性對照和空白對照。取含有已知蛙病毒參考株的細(xì)胞懸液或含有病毒目的片段的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為陽性對照取正常的細(xì)胞懸液作為陰性對照；取等體積的水代替模板作為空白對照。8.5瓊脂糖電錄用TBE電泳緩沖液(見A-6)配置2%的瓊脂糖(0.5pg/mLEB,見A.7平板。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩中液剛好淹沒膠面。將6pL樣品和2μL樣品緩沖液(見A.8混勻后加入樣品孔。在電泳時(shí)設(shè)立DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量做對照。120V電泳約0.5h,當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部時(shí)停止。在紫外燈下或者凝膠成像儀中觀察核酸帶并判斷結(jié)果。陽性對照應(yīng)在585bp處出現(xiàn)條帶；陰性對照和空白對照均無該條帶。樣品經(jīng)PCR檢測后，在585bp處出現(xiàn)條帶者，可判斷為PCR陽性。如需要進(jìn)一步鑒定到種，可以取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序，并和基因庫(GENBANK)中公布的各種蛙病毒NA序列進(jìn)行比較，以進(jìn)行蛙病毒種類的鑒定。蛙病毒3型主要衣殼蛋白的參考序列(585bp)參見附錄B。無條帶出現(xiàn)或條帶的大小不是585bp的.均判為PCR陰性。從樣品中分離到病毒并經(jīng)PCR檢測為陽性，或有臨床癥狀的樣品經(jīng)PCR直接檢測結(jié)果為陽性者，都可判定為蛙病毒陽性。通過測序并和基因庫(GENBANK)中已知的各種蛙病毒DNA序列比較后能進(jìn)一步確認(rèn)該病毒的種類。4按CTAB2%,NaCl1.4mol/L,EDTA20mA.4抽提液1A.5抽提液25CGCAGTCAAGGCCTTGATGTTTATGGTGCAGAACTCGTGGGAGTCGGCAACACGGTCCTGGACCACAAGGCTcCCCGACATGGGAGTCGAGTACTACTCGCTGGTGGAGCCCTGGTACTATGCCACCTCCACACCGGGCACCACCTCTACTCTTATGCCCTCAGCCTGCAGGACCCCCACCCCAACGCCAGCCTTAACGTCACCCTGTCCGACCACCGCCCAAAAGTACGC