TGXAS-家蠶核型多角體病毒(BmNPV)制備技術(shù)規(guī)程

Q/LB.□XXXXX-XXXX前言本文件參照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站提出、歸口并宣貫。本文件起草單位：廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站、河池市蠶業(yè)技術(shù)推廣站、廣西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院。本文件主要起草人：安春梅、黃文功、閉立輝、黃揚玉、吳靜顏、劉艷偉、浦月霞、莫嘉凌、黃康東、黃玲莉、李楓燁、覃龍偉、韋博尤、蘇紅梅、強(qiáng)艷芳、蘭艷妮、黃凌、李嘉。家蠶核型多角體病毒(BmNPV)制備技術(shù)規(guī)程范圍本文件確立了家蠶核型多角體病毒（BmNPV）制備技術(shù)的程序，界定了制備技術(shù)涉及的術(shù)語和定義，規(guī)定了設(shè)施設(shè)備、核型多角體病毒制備的原則，以及家蠶核型多角體病毒復(fù)壯、擴(kuò)繁、收集、提取、清洗、保存等操作指示。本文件適用于廣西行政區(qū)域家蠶核型多角體病毒(BmNPV)的制備。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。DB45/T83種繭育養(yǎng)蠶技術(shù)規(guī)程術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。復(fù)壯rejuvenation將致病力下降的家蠶核型多角體病毒用經(jīng)口添食的方法感染家蠶，使其致病力恢復(fù)的過程。擴(kuò)繁proliferationandreplication家蠶核型多角體病毒進(jìn)入宿主，在宿主體內(nèi)產(chǎn)生大量子代病毒的過程。設(shè)施設(shè)備設(shè)復(fù)壯擴(kuò)繁房間、病毒提取房間。復(fù)壯擴(kuò)繁房間應(yīng)配備配置蠶架、蠶匾等附屬蠶具，溫濕度調(diào)控設(shè)備、消毒機(jī)具。病毒提取房間配備光學(xué)顯微鏡、低速離心機(jī)、血球計數(shù)器、純水機(jī)、冰箱、移液槍等。家蠶核型多角體病毒（BmNPV）制備原則病毒制備過程中產(chǎn)生的可能含病毒的廢渣廢液在病毒滅活后作無害化處理，嚴(yán)防病毒擴(kuò)散到環(huán)境中。病原復(fù)壯擴(kuò)繁活體病原復(fù)壯擴(kuò)繁活體蛹注射組織破碎收集病蛹/蠶經(jīng)口添食5齡蠶加超純水保存清洗過濾離心去底部大顆粒沉淀離心收集沉淀見圖1。家蠶核型多角體病毒（BmNPV）制備技術(shù)流程技術(shù)要求病原復(fù)壯家蠶核型多角體病毒配制成高濃度（1×108?PIBs/ml以上）的病毒懸液，取桑葉在病毒懸液中浸泡，撈起晾干表面水分后添食BmNPV敏感品系的5齡起蠶，第2餐開始普通桑葉飼養(yǎng)，5?d～6?d后收集出現(xiàn)典型病癥還未皮膚破裂的活蠶，用75?％的酒精消毒蠶體，晾干后剪尾角收集血液備用。取血后的蠶體經(jīng)破碎過濾離心后收集多角體病毒。擴(kuò)繁增殖擴(kuò)繁采用注射活蛹和添食5齡起蠶2種方式進(jìn)行?；钣甲⑸溥x擇化蛹后24?h～48?h的BmNPV敏感品系健康蠶蛹，用注射器將病復(fù)壯后取得的病蠶血液斜刺入蛹體皮下，將病原接種到蠶蛹中。接種后的蠶蛹置于25?℃～29?℃的條件下發(fā)育96?h～120?h，收集發(fā)病癥狀明顯的病蛹。收集的病蛹于-18?℃冰箱保存。經(jīng)口添食5齡起蠶經(jīng)復(fù)壯的多角體病毒加入超純水，配置成較高濃度（1×108?PIBs/ml以上）的病毒懸液備用。取桑葉在病毒懸液中浸泡，撈起晾干表面水分后喂食BmNPV敏感品系的5齡起蠶，第2餐開始改喂新鮮普通桑葉正常飼養(yǎng)，5?d～6?d后收集出現(xiàn)典型病癥的病蠶，收集的病蠶于-18?℃冰箱保存。病毒的提取純化與保存組織破碎將收集到的病蠶或病蛹，加入適量超純水破碎組織。過濾加入超純水?dāng)嚢杈鶆?，?0目濾網(wǎng)過濾，濾渣再加入超純水?dāng)嚢柙龠^濾，重復(fù)2次，收集濾液。離心收集的濾液500?rpm離心10?min，收集上層懸浮液，反復(fù)多次，直到500?rpm離心10?min后底部無大顆粒沉淀。將收集的懸浮液3000?rpm～4000?rpm離心10?min，留沉淀。清洗在收集的沉淀中加入超純水，重懸成懸浮液，3000?rpm～4000?rpm離心10?min，留沉淀。多次重復(fù)此步驟，直至沉淀呈現(xiàn)出灰白色