(高清版)GB∕T 38788-2020 豬多能干細(xì)胞建系技術(shù)規(guī)范

B43中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)豬多能干細(xì)胞建系技術(shù)規(guī)范T國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會ⅠGB／T38788—2020本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院。1GB／T38788—2020豬多能干細(xì)胞建系技術(shù)規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬多能干細(xì)胞建系的一般要求、技術(shù)要求、證實(shí)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和豬胚胎干細(xì)胞建系。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1干細(xì)胞一類能夠自我更新，具有多向分化潛能，能分化形成多種細(xì)胞類型的細(xì)胞。3.2多能干細(xì)胞能夠分化成多種類型細(xì)胞的干細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞、核移植胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞等。3.3胚胎干細(xì)胞源自早期胚胎中內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的初始未分化細(xì)胞，可在體外“無限制地”自我更新，并且具有向三胚層細(xì)胞分化潛能的干細(xì)胞。3.4誘導(dǎo)多能干細(xì)胞一類通過細(xì)胞重編程技術(shù)人工誘導(dǎo)獲得的，具有類似于胚胎干細(xì)胞特性的干細(xì)胞。3.5核移植胚胎通過顯微操作將細(xì)胞核注射到去核卵母細(xì)胞中，經(jīng)體外培養(yǎng)發(fā)育成的胚胎。3.6孤雌胚胎處于第二次減數(shù)分裂中期的成熟卵母細(xì)胞不經(jīng)精子受精作用，而在理化因素的刺激下發(fā)生卵裂發(fā)育成的胚胎。3.7體外受精胚胎精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精而發(fā)育成的胚胎。2GB／T38788—20203.8初始態(tài)能夠?qū)崿F(xiàn)生殖系嵌合發(fā)育或者四倍體嵌合發(fā)育能力的多能干細(xì)胞所具有的多能性狀態(tài)。3.9激發(fā)態(tài)具有體外自我更新和三胚層分化能力但不具有生殖系嵌合發(fā)育或者四倍體嵌合發(fā)育能力的多能干細(xì)胞所具有的多能性狀態(tài)。擬胚體將多能干細(xì)胞在體外懸浮培養(yǎng)形成的具有內(nèi)、中、外三個胚層祖細(xì)胞的細(xì)胞聚集體?；チ鰜碓从诙嗄芨杉?xì)胞，含有內(nèi)、中、外三個胚層組織成分的良性腫瘤。嵌合體動物由兩種或兩種以上具有不同遺傳特性的細(xì)胞系組成的聚合胚胎發(fā)育形成的動物個體。飼養(yǎng)層細(xì)胞經(jīng)藥物或輻射處理失去分裂增殖能力，用來支持多能干細(xì)胞或其他類型細(xì)胞體外培養(yǎng)的一類細(xì)胞。細(xì)胞凍存將細(xì)胞保存在低溫環(huán)境中，使其暫時脫離生長狀態(tài)但最大限度保持活性的細(xì)胞儲存操作。細(xì)胞復(fù)蘇將保存在低溫環(huán)境中的細(xì)胞解凍之后重新培養(yǎng)，使其恢復(fù)活力的操作。4一般要求干細(xì)胞的來源和胚胎獲得方式應(yīng)符合生命倫理與社會道德規(guī)范。5技術(shù)要求5.1豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞建系外源因子的導(dǎo)入和克隆挑取5.1.1外源因子的導(dǎo)入包括整合和非整合兩種方式，整合的方法可以通過逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒等載體導(dǎo)入外源因子，將外源基因整合到宿主細(xì)胞基因組中。非整合的方法可以通過腺病毒、仙臺病毒、表達(dá)系統(tǒng)等載體導(dǎo)入外源因子，外源因子不整合到基因組上。5.1.2每日觀察并記錄經(jīng)外源因子誘導(dǎo)后的豬成纖維細(xì)胞生長狀態(tài)，3d~4d可以出現(xiàn)明顯的細(xì)胞增殖和細(xì)胞形變，7內(nèi)出現(xiàn)克隆。待克隆出現(xiàn)后，挑取邊緣清晰、形態(tài)飽滿的單克隆進(jìn)行酶消化，并接種到飼養(yǎng)層細(xì)胞上繼續(xù)傳代培養(yǎng)。5.2豬胚胎干細(xì)胞建系胚胎的選擇和源頭細(xì)胞分離方法5.2.1用于豬胚胎干細(xì)胞建系的胚胎應(yīng)選擇高質(zhì)量的體內(nèi)胚胎或體外培養(yǎng)獲得的胚胎，體外培養(yǎng)胚胎可選擇核移植胚胎、孤雌胚胎、體外受精胚胎或聚合胚胎等。根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)體系的不同應(yīng)選擇不同發(fā)育3GB／T38788—2020時期的胚胎進(jìn)行建系，4-8細(xì)胞時期胚胎、桑葚胚時期胚胎、早期囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、晚期囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)以及球形胚胎的上胚層細(xì)胞等。5.2.2用于豬胚胎干細(xì)胞建系的源頭細(xì)胞可用全胚接種法，將獲得的早期胚胎直接接種到相應(yīng)的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，待其貼壁形成原代克隆后進(jìn)行傳代培養(yǎng)；機(jī)械切割法，用胚胎分割刀或細(xì)玻璃針分割胚胎，獲得內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞進(jìn)行接種培養(yǎng)；酶消化法，將去掉透明帶的囊胚置于0.胰蛋白酶-0.細(xì)胞消化液中消化使滋養(yǎng)層細(xì)胞脫落獲得內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞進(jìn)行接種培養(yǎng)。5.3細(xì)胞培養(yǎng)及傳代5.3.1將細(xì)胞接種在狀態(tài)良好，密度適宜的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，及時更換新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中應(yīng)添加相應(yīng)信號通路的小分子抑制劑或細(xì)胞因子。培養(yǎng)基、細(xì)胞因子和小分子應(yīng)符合相應(yīng)質(zhì)量要求。使用動物血清時，應(yīng)無特定動物源性病毒的污染。5.3.2原代豬胚胎干細(xì)胞克隆傳代時，由于克隆細(xì)胞數(shù)較少且對酶的作用敏感，因此可采用機(jī)械分割的方法進(jìn)行傳代；待細(xì)胞數(shù)增多，狀態(tài)穩(wěn)定后可用較為溫和的酶進(jìn)行消化傳代。5.4豬多能干細(xì)胞的鑒定根據(jù)培養(yǎng)體系的不同，細(xì)胞可呈現(xiàn)兩種不同的形態(tài)。一種為邊界清晰，形態(tài)扁平，呈上皮樣的激發(fā)態(tài)細(xì)胞；另一種為邊界清晰，排列緊密，克隆立體的初始態(tài)細(xì)胞。不同形態(tài)細(xì)胞圖參見附錄A。5.4.2堿性磷酸酶染色對豬多能干細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色，多能性較好的干細(xì)胞系應(yīng)呈AP陽性，多能性較弱或無多能性的細(xì)胞系A(chǔ)P染色呈弱陽性或陰性。5.4.3多能性基因表達(dá)豬多能干細(xì)胞應(yīng)表達(dá)核心多能性基因POU5F1、NANOG、SOX2等；可表達(dá)KLF4、KLF2、REX1、NROB1、ESRRB、ZIC3、LIN28A、LIN28B、DNMT3B、PRDM14、STAT3、TCF3、TFCP2L1等多能性基因；豬多能干細(xì)胞應(yīng)表達(dá)干細(xì)胞表面特異性標(biāo)記蛋白SSEA-1或SSEA-4,可表達(dá)SSEA-3、TRA-1-81和TRA-1-60等。豬多能干細(xì)胞應(yīng)具有正常穩(wěn)定的二倍體核型，雌性多能干細(xì)胞系應(yīng)包括18對常染色體和一對性染色體(XX),雄性多能干細(xì)胞系應(yīng)包括18對常染色體和一對性染色體(XY)。5.4.5X染色體激活在雄性的豬多能干細(xì)胞系中，只有一條X染色體，處于激活狀態(tài)；在雄性的豬多能干細(xì)胞系中，初始態(tài)的細(xì)胞兩條X染色體應(yīng)處于激活狀態(tài)激發(fā)態(tài)的細(xì)胞其中一條X染色體應(yīng)處于失活狀態(tài)XaXi。豬多能干細(xì)胞注射到免疫缺陷小鼠的皮下或腎囊中可在注射部位形成畸胎瘤實(shí)體，能夠觀察到具有內(nèi)胚層、中胚層和外胚層三個胚層的組織。4GB／T38788—20205.4.7生殖腺嵌合能力將豬多能干細(xì)胞注射到豬早期胚胎內(nèi)，注射的細(xì)胞應(yīng)能在胚胎中嵌合并增殖；將嵌合胚胎移植到受體子宮，能夠獲得具有生殖系嵌合能力的嵌合體動物。5.5細(xì)胞凍存細(xì)胞凍存時應(yīng)進(jìn)行梯度降溫，冷凍速度開始為-1℃/min~-2℃/min,當(dāng)溫度低于-25℃時可加速，到-80℃之后可保存在液氮中。凍存過程中應(yīng)標(biāo)明細(xì)胞名稱、數(shù)量、代次、日期、培養(yǎng)條件、操作者等信息。5.6細(xì)胞復(fù)蘇從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃水浴鍋中，并不時搖動令其盡快融化。復(fù)蘇后的細(xì)胞應(yīng)能夠正常增殖并維持多能性狀態(tài)。6證實(shí)方法6.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)試驗(yàn)100倍或200倍光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。6.2細(xì)胞標(biāo)志蛋白檢測收集單細(xì)胞，250g離心3min。棄上清液，加適量固定液冰上放置10min,然后用適量洗滌液洗滌每次用封閉通透液重懸細(xì)胞并把細(xì)胞分成兩等份，分別作為實(shí)驗(yàn)組和Isotype同型對照組，冰上孵育20min,然后用洗滌液清洗一遍。按照抗體說明書進(jìn)行稀釋使用。用洗滌液重懸細(xì)胞，然后通過40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細(xì)胞儀應(yīng)用手冊上機(jī)檢測。首先根據(jù)顆粒度和透光性設(shè)門圈出目標(biāo)細(xì)胞分群1,排除死細(xì)胞和其他雜細(xì)胞，然后根據(jù)Isotype同型對照組熒光強(qiáng)度，在分群1的基礎(chǔ)上畫出陽性細(xì)胞群2,排除沒有被熒光抗體標(biāo)記的陰性細(xì)胞?？贵w同型對照Isotype作為陰性對照。得到的檢測結(jié)果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明。GB／T38788—20206.3畸胎瘤形成檢測離心收集細(xì)胞于離心管中，用生理鹽水輕輕重懸細(xì)胞，避免形成氣泡或者殘留細(xì)胞團(tuán)塊。實(shí)驗(yàn)室要求應(yīng)符合GB19489的規(guī)定，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682規(guī)定的一級水。用注射器將1×106~1×107個豬多能干細(xì)胞注射到6周齡~8周齡的免疫缺陷型小鼠皮下，或肌肉，或睪丸白膜下的生精小管周隙等部位。6.3.3畸胎瘤收樣及處理豬多能干細(xì)胞注射約6周~10周后（確保畸胎瘤不超過荷載小鼠體重的15%),對小鼠實(shí)施安樂死。剝離受體小鼠上的畸胎瘤并進(jìn)行切割（體積不大于5mm×5mm×2mm),將畸胎瘤組織塊用4%多聚甲醛進(jìn)行4℃過夜固定。6.3.4石蠟切片及HE染色對上述固定好的樣本進(jìn)行石蠟包埋、切片和HE染色，鏡下觀察并拍照。觀察到來源于三個胚層的組織，如：內(nèi)胚層來源的消化道上皮腺體樣組織、中胚層來源的軟骨組織，以及外胚層來源神經(jīng)組織等，即證明所接種的豬多能干細(xì)胞具有向三個胚層組織分化的多能性。56GB／T38788—2020附錄A（資料性附錄）豬多能