guan-5-基因工程課件

基因工程的基本內(nèi)容1guan-5-基因工程基因工程的基本內(nèi)容引入基因工程的概念基因操作的工具基因操作的基本步驟小結(jié)2guan-5-基因工程基因決定性狀（一）青霉菌能產(chǎn)生對(duì)人類有用的抗生素——青霉素3guan-5-基因工程基因決定性狀（二）家蠶能夠吐出蠶絲為人類利用4guan-5-基因工程基因決定性狀（三）豆科植物的根瘤能夠固定空氣中的氮5guan-5-基因工程定向基因改造設(shè)想

設(shè)想一能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的氮？能否讓細(xì)菌“吐出”蠶絲？設(shè)想二能否讓微生物產(chǎn)生出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物？設(shè)想三經(jīng)過多年的努力，科學(xué)家于20世紀(jì)70年代創(chuàng)立了可以定向改造生物的新技術(shù)——基因工程。6guan-5-基因工程7guan-5-基因工程基因工程概念

基因工程：在生物體外，通過對(duì)DNA分子進(jìn)行人工“剪切”和“拼接”，對(duì)生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出所需要的基因產(chǎn)物。基因工程的別名基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)操作環(huán)境生物體外操作對(duì)象基因操作水平DNA分子水平基本過程剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)結(jié)果人類需要的基因產(chǎn)物8guan-5-基因工程

基因工程的特點(diǎn)◆基因工程有兩個(gè)基本的特點(diǎn)∶分子水平上的操作和細(xì)胞水平上的表達(dá)?！艋蚬こ碳夹g(shù)的誕生使人們能夠在試管里進(jìn)行分子水平上的操作，象一項(xiàng)工程那樣，進(jìn)行按圖施工的操作，構(gòu)建在生物體內(nèi)難以進(jìn)行的重組體，然后將重組的遺傳物質(zhì)引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞，讓其在宿主細(xì)胞中進(jìn)行工作?！暨@實(shí)際上是進(jìn)行無性繁殖，即克隆，所以基因工程通常又稱為基因克隆。9guan-5-基因工程◆基因工程的對(duì)象是基因，所以如果是獲得商品的話，就是基因的產(chǎn)品，或是改變了遺傳性的細(xì)胞和個(gè)體。如果要獲得效益的話，除了經(jīng)濟(jì)效益之外，還有巨大的社會(huì)效益?！艋蚬こ痰膶?duì)象是基因，而基因要安居才能樂業(yè)，也就是說基因需要在宿主細(xì)胞中工作。它需要在體外操作，然后送到細(xì)胞中去進(jìn)行表現(xiàn)?；蚬こ痰奶攸c(diǎn)10guan-5-基因工程基因操作的工具基因的剪刀——限制性內(nèi)切酶基因工程過程示意圖基因的針線——DNA連接酶基因的運(yùn)輸工具——運(yùn)載體11guan-5-基因工程基因工程過程示意圖①從細(xì)胞中分離出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③分離大腸桿菌中的質(zhì)粒④DNA重組⑤用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因12guan-5-基因工程基因克隆操作13guan-5-基因工程限制性內(nèi)切酶分布：主要在微生物中。特點(diǎn)：特異性，即識(shí)別特定核苷酸序列，切割特定切點(diǎn)。結(jié)果：產(chǎn)生黏性未端（堿基互補(bǔ)配對(duì)）。舉例：大腸桿菌的一種限制酶能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開。14guan-5-基因工程一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切割點(diǎn)上將DNA分子切斷。目前已發(fā)現(xiàn)的限制酶有200多種。5’3’15guan-5-基因工程DNA連接酶連接酶的作用：將互補(bǔ)配對(duì)的兩個(gè)黏性末端連接起來，使之成為一個(gè)完整的DNA分子。連接的部位：磷酸二酯鍵，不是氫鍵。DNA連接酶的作用過程16guan-5-基因工程DNA連接酶的作用原理17guan-5-基因工程DNA連接酶的作用過程18guan-5-基因工程運(yùn)載體作用：將外源基因送入受體細(xì)胞。條件：能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定地保存。具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)。具有某些標(biāo)記基因種類：質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒。質(zhì)粒的特點(diǎn)要讓一個(gè)從甲生物細(xì)胞內(nèi)取出來的基因在乙生物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，首先得將這個(gè)基因送到乙生物的細(xì)胞內(nèi)去。能將外源基因送入細(xì)胞的工具就是運(yùn)載體。19guan-5-基因工程質(zhì)粒20guan-5-基因工程質(zhì)粒的特點(diǎn)細(xì)胞染色體外能自主復(fù)制的小型環(huán)狀DNA分子；質(zhì)粒是基因工程中最常用的運(yùn)載體；最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒；存在于許多細(xì)菌及酵母菌等生物中；質(zhì)粒的存在對(duì)宿主細(xì)胞無影響；質(zhì)粒的復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)完成。21guan-5-基因工程基因操作的基本步驟提取目的基因目的基因與運(yùn)載體結(jié)合將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)和表達(dá)一目的基因的檢測(cè)和表達(dá)二22guan-5-基因工程提取目的基因?qū)⑿枰幕驈墓w生物的細(xì)胞內(nèi)提取出來。取出DNA用限制酶切斷DNA

目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。23guan-5-基因工程提取目的基因的方法（一）

直接分離基因——鳥槍法

將供體生物的DNA用限制酶切割為許多片段，再用運(yùn)載體將這些片段都運(yùn)載到受體生物的不同細(xì)胞中去。只要有一個(gè)細(xì)胞獲得了需要的目的基因并得以表達(dá)，基因工程就算成功了。該法最大的缺點(diǎn)是帶有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能將真核生物的基因轉(zhuǎn)移到原核生物中去。用限制酶切成許多片斷24guan-5-基因工程提取目的基因的方法（二）

人工基因合成法逆轉(zhuǎn)錄法：以信使RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將脫氧核苷酸合成合成DNA(基因)。直接合成法：根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸順序推算出信使RNA核苷酸順序，再據(jù)此推算出基因DNA的脫氧核苷酸順序。用游離脫氧核苷酸直接合成相應(yīng)的基因。DNA合成儀PCR擴(kuò)增儀25guan-5-基因工程目的基因與運(yùn)載體結(jié)合用與提取目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒使之出現(xiàn)一個(gè)切口，將目的基因插入切口處，讓目的基因的黏性末端與切口上的黏性末端互補(bǔ)配對(duì)后，在連接酶的作用下連接形成重組DNA分子。提取質(zhì)粒并用限制酶切割用連接酶將目的基因和質(zhì)粒連接26guan-5-基因工程將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并擴(kuò)增基因工程中常用的受體細(xì)胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。導(dǎo)入受體細(xì)胞常用的方法是借鑒細(xì)菌或者病毒侵染細(xì)胞的途徑。通常還要對(duì)一些受體細(xì)胞進(jìn)行增大通透性的處理。目的基因可以隨著受體細(xì)胞進(jìn)行快速的繁殖，在很短的時(shí)間內(nèi)獲得大量的基因。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增27guan-5-基因工程目的基因的檢測(cè)和表達(dá)（一）

前三步的處理十分繁鎖，為保證目的基因得到有效利用，通常用大量的受體細(xì)胞來接受不多的目的基因。這樣，處理的受體細(xì)胞中真正攝入了目的基因的很少，必須將它從中檢測(cè)出來。

細(xì)菌的檢測(cè)，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)形成菌落，檢測(cè)菌落中是否有目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。淘汰無表達(dá)產(chǎn)物的菌落，保留有表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。無表達(dá)產(chǎn)物無表達(dá)產(chǎn)物有表達(dá)產(chǎn)物無表達(dá)產(chǎn)物28guan-5-基因工程目的基因的檢測(cè)和表達(dá)（二）多細(xì)胞生物的檢測(cè)，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)并誘導(dǎo)發(fā)育成完整個(gè)體，檢測(cè)這些個(gè)體是否攝入目的基因，攝入的基因是否表達(dá)（是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀）。淘汰無變化的個(gè)體，保留有相應(yīng)變化的個(gè)體進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。29guan-5-基因工程體外操作與細(xì)胞內(nèi)表達(dá)30guan-5-基因工程基因工程技術(shù)的誕生1基因工程的技術(shù)準(zhǔn)備

基因工程技術(shù)的誕生不僅依賴于基因分子生物學(xué)理論的發(fā)展，同時(shí)也有賴于一些重要的分子生物學(xué)研究方法的建立。最重要的技術(shù)準(zhǔn)備是限制性酶的分離純化、DNA連接酶的分離、大腸桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)的突破。到1970年，這三大技術(shù)都已經(jīng)建立，“萬事齊備，只欠東風(fēng)”了。到了1972～1973年，兩位科學(xué)助產(chǎn)士Berg和Cohen將基因工程接到了人間。31guan-5-基因工程基因工程技術(shù)的誕生32guan-5-基因工程

第一個(gè)重組體的構(gòu)建

1972年，美國斯坦福大學(xué)P.Berg等在PNAS上發(fā)表了題為∶“BiochemicalmethodeforinsertingnewgeneticinformationintoDNAofSimianVirus40:circularSV40DNAmoleculescotaininglamdaphagegenesandthegalactoseoperonofEscherichiacoli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:2904-2909,1972”，標(biāo)志著基因工程技術(shù)的誕生。33guan-5-基因工程第一個(gè)重組體構(gòu)建34guan-5-基因工程

SV40病毒是猿猴病毒，是一種直徑為450?的球形病毒，分子量為28×106道爾頓。SV40的DNA是環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu)，全長(zhǎng)5243個(gè)堿基對(duì)。SV40DNA上有一個(gè)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ的切點(diǎn)。35guan-5-基因工程SV40病毒36guan-5-基因工程◆當(dāng)獲得二聚體SV40DNA后，Berg等就證明了環(huán)狀DNA被內(nèi)切酶切成線性DNA后能夠重新環(huán)化，并且能夠同另外的分子重組。

◆于是他們進(jìn)行第二步的實(shí)驗(yàn)就是從λdvgal

DNA中制備含有E.coli的半乳糖操縱子DNA，用上述同樣的方法進(jìn)行重組連接，并獲得成功。37guan-5-基因工程

第一個(gè)有功能重組體的構(gòu)建◆雖然Berg的工作具有劃時(shí)代的意義，但是他們并沒有證明體外重組的DNA分子具有生物學(xué)功能?！?973年，Cohen等在美國PNAS上發(fā)表了題為“ConstructionofBiologicallyFunctionalBacterialPlasmidInVitro”（S.N.Cohen,A.C.Y.Chang,H.W.Borer,andR.B.Helling,Proc.Natl.Acad.Sci.USA70:3240-3244,1973）的論文，宣布體外構(gòu)建的細(xì)菌質(zhì)粒能夠在細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),從而完善了Berg開創(chuàng)的基因重組技術(shù)。38guan-5-基因工程BoyerandCohen39guan-5-基因工程◆質(zhì)粒

pSC101的獲得●In1972,CohenconstructedanewplasmidbeginningwithDNAisolatedfromE.coli.CohennamedtheplasmidpSC101(“SC"forStanleyCohen).Thenewplasmidhadthreeimportantfeatures:ithadonlyasinglerecognitionsitewhereEcoRIwouldcutthemolecule,thusidentifyingthespotwheretheplasmidwouldopen;(2)ithadasequenceofnucleotidescalledanoriginofreplication,whichisneededtoinitiateDNAreplication;suchasequencestimulatesplasmidstomultiplyinahostorganism;(3)itcontainedageneforresistancetotheantibiotictetracycline;thus,bacteriahavingtheplasmidcouldresisttheeffectsoftetracycline,whereasbacterialackingtheplasmidwouldbekilledbythetetracycline.Cohen在重組DNA技術(shù)中杰出貢獻(xiàn)40guan-5-基因工程pSC101質(zhì)粒DNA41guan-5-基因工程◆質(zhì)粒

pSC101對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)突破●AnotherkeycharacteristicofCohen'splasmidwastheeaseofinsertingittoahostcell.Cohenfoundthathecouldinsertplasmidstofreshbacteriabysuspendingthelatterincoldcalciumchloride,thenrapidlyheatingthebacteriato42oC.Sotreated,thebacterialwallandplasmamembraneopentopermittheplasmidstopassthroughandintothecytoplasm.Cohen在重組DNA技術(shù)中杰出貢獻(xiàn)42guan-5-基因工程◆Cohen與Boyer合作創(chuàng)建重組DNA分子●Tosomehistorians,thedisciplineofDNAtechnologycameintobeingoverpastramisandwichesatalocaldelicatesseninWaikikiBeach.Theyearwas1972.●IthappenedthatHerbertBoyerwasatascientificconferenceinHawaiispeakingabouttheEcoRlrestrictionenzyme.StanleyCohenwasintheaudience.●Afterthepresentation,CoheninvitedBoyertolunchtoexploretheirpossiblecollaborationonaseriesofexperiments.●ThetworesearcherssatandconsideredtheexperimentsthatwouldsendDNAtechnologyintoanewera.Cohen在重組DNA技術(shù)中杰出貢獻(xiàn)43guan-5-基因工程◆Cohen與Boyer合作創(chuàng)建重組DNA分子●Cohenhadbeenconductingfruitfulexperimentswithplasmids,buthewasexperiencingdifficultycuttingopentheplasmids.●Boyer'sEcoRIenzymeseemedtobetheidealsolution,soCohensuggestedtheyjoinforces.●TheywouldusehisplasmidsandBoyer'senzymetorecombinetheplasmidDNA.■Firsttheywouldtrytorecombinetwoplasmidstoformasingleplasmid.■Ifsuccessful,theywouldattempttobringDNAfromaforeignspeciesintotheplasmidtoproducearecombinantDNAmolecule.Boyeragreed,andthebargainwasstruck.Cohen在重組DNA技術(shù)中杰出貢獻(xiàn)44guan-5-基因工程BoyerandCohen的策略45guan-5-基因工程◆pSC102,體內(nèi)構(gòu)建的重組體●他們首先檢查了EcoRⅠ對(duì)質(zhì)粒pSC101和R6-5的切割情況，發(fā)現(xiàn)EcoRⅠ在質(zhì)粒pSC101上只有一個(gè)切點(diǎn)，在質(zhì)粒R6-5上有12個(gè)切點(diǎn),這樣就可以用pSC101作為重組DNA的載體分子。46guan-5-基因工程

他們用EcoRⅠ處理過的和沒有處理過的質(zhì)粒pSC101和R6-5DNA分別轉(zhuǎn)化E.coliC600,得到下表的實(shí)驗(yàn)結(jié)果∶

表：環(huán)狀和線狀質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA每μgDNA轉(zhuǎn)化子四環(huán)素卡那霉素氯霉素pSC101(未切割)3×105------(EcoRⅠ切割)2.8×104------R6-5(未切割)----1.3×1041.3×104R6-5(EcoRⅠ切割)

＜51×1024×10147guan-5-基因工程

◆他們從用EcoRⅠ處理的R6-5的卡那霉素抗性平板上選擇了一個(gè)克隆，并檢查了它的抗性，發(fā)現(xiàn)該克隆同時(shí)具有磺胺的抗性，但沒有氯霉素、四環(huán)素的抗性。然后從該克隆中分離了一個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒DNA，命名為pSC102，分子量大約為17×106。48guan-5-基因工程◆接著用EcoRⅠ分別切割pSC102和R6-5質(zhì)粒DNA，進(jìn)行電泳檢查，發(fā)現(xiàn)pSC102被切成三個(gè)片段，相對(duì)于質(zhì)粒R6-5的EcoRⅠ酶切片段Ⅲ、Ⅴ和Ⅷ。◆這些結(jié)果說明不同的酶切片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌后能夠在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行