臨床實驗室檢測和體外診斷系統(tǒng) 感染性疾病相關(guān)酵母樣真菌抗微生物藥物的體外活性檢測肉湯微量稀釋參考方法 征求意見稿

本文件描述了檢測酵母樣真菌抗真菌藥物的敏感性的方法，包括引起感染的念珠菌屬和新型隱球菌。這里描述的參考方法尚未用于雙相型真菌的酵母相菌研究，如皮炎芽生菌和/或莢膜組織胞漿菌莢法)[1][5];第二種途徑通過光度法確定MIC(EUCAST方法)[2][10]。MIC反活性，并在考慮到其它因素下可對臨床管理目的進行解釋，如藥物的藥理學(xué)或抗真菌耐藥機制。另外方法和EUCAST衍生方法的解釋性分類折點可查詢相應(yīng)機構(gòu)提供的最新解釋表[5][15]。推薦常規(guī)敏感性試驗方法或診斷檢驗器械與此參考方法進行比較，以保證驗證或注冊ISO和IEC維護的用于標(biāo)準(zhǔn)化工作的術(shù)語數(shù)據(jù)庫—ISO在線瀏覽平臺：指受試物活性部分所占比例，通過生物分析方法與相同物質(zhì)的參考品比注：效價可表達為受試物中組分以毫克每克（mg/g）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、或以國際單位每克（IU/g）的活性含量、或以體積分?jǐn)?shù)或質(zhì)量分?jǐn)?shù)的百分含量或摩爾數(shù)每升2最低抑菌濃度minimuminhibitory參考菌株referencestrains有特定分類編號，具有穩(wěn)定、確定的抗真菌藥物敏感性表型和/或基因型的特征明確的真菌注：參考菌株是從菌種保藏機構(gòu)獲得并用于質(zhì)量控制，其通常以貯是一種容器中加入適當(dāng)體積抗真菌（3.1）溶液，該抗真增加，再加入適當(dāng)體積的含一定接種量（3.9）菌液肉湯（3注：接種量以每毫升的菌落形成單位（CFU/3抗真菌藥物相比會導(dǎo)致MIC升高。這種處理可能會影響這些藥物的微量稀釋板并通過光度計讀數(shù)的實驗室宜確保測試使用處理過的稀釋板給出與表5中所示相同的質(zhì)量使用處理過的稀釋板[2]通過肉眼判讀方法[5]提供的結(jié)果和光度判讀法兩種測試方法用于臨床分離株比4的保存條件，否則受試物應(yīng)保存于密閉容器中，避光、-20℃、使用干燥劑。易吸濕的試劑宜分裝成小價，通過公式（1）和公式（2）計算出標(biāo)準(zhǔn)液品宜通過分析進行比較以確?？拐婢幬飿悠吩诔^程中未發(fā)生吸附損除非原液有在規(guī)定貯存條件下的穩(wěn)定性信息5(最高濃度和中間溶液)兩性霉素B(AmphotericinB)培養(yǎng)基阿尼芬凈(Anidulafungin)培養(yǎng)基卡泊芬凈(Caspofungin)培養(yǎng)基氟胞嘧啶(Flucytosine)培養(yǎng)基氟康唑(Fluconazole)培養(yǎng)基培養(yǎng)基伊曲康唑(Itraconazole)培養(yǎng)基酮康唑(Ketoconazole)培養(yǎng)基米卡芬凈(Micafungin)培養(yǎng)基泊沙康唑(Posaconazole)培養(yǎng)基里氟康唑(Ravuconazole)培養(yǎng)基（Rezafungin）培養(yǎng)基伏立康唑(Voriconazole)培養(yǎng)基考菌株來說，應(yīng)能夠確定所有可能得出的終點MIC值。倍比稀釋系列以1mg/L為中心濃度，用RPMI-1640葡萄糖肉湯配制。宜遵從表2和表物溶液有來自廠家在指定貯存條件下的穩(wěn)定性信息，所有工作液均應(yīng)當(dāng)天配制當(dāng)天使用。6步驟源+==1726354458364272181095步驟源+==142332415067897每個測試菌株還宜設(shè)置一個只加入200μl無抗真菌藥物培養(yǎng)基作為未接種充裝好的微量稀釋板可以立即使用，也可以放在密封塑料袋中迅速冷凍貯存(CLSI法，肉眼判讀:4.6.1概述每個分離菌株都宜轉(zhuǎn)種到非抑制性瓊脂培養(yǎng)基以確保純度8用渦旋混合器混合已調(diào)整好的酵母菌懸液，用滅菌蒸餾水1:10稀釋，得到兩倍濃度測試接種量應(yīng)定期對微量稀釋板的陽性對照孔進行活菌計數(shù)，以確保脂平板（如沙保弱葡萄糖瓊脂）表面35±2℃)孵育24h后，進行菌計數(shù)，可接受菌懸液菌落數(shù)量應(yīng)該在5～125之間。對于多數(shù)抗真菌藥物-酵母菌組合，微量稀釋板在(35±2)℃的大氣環(huán)境中孵育（24±2）h。某些新在24h孵育后可以讀數(shù)。這些信息的更新見CLSI文件M60ED29種的或陰性生長對照孔（如有）沒有生長、接種菌液純度已確立，才可進行結(jié)果判某些抗真菌藥和某些分離株，可能發(fā)生拖尾生長（在抗真菌藥物濃度一定范圍內(nèi)出現(xiàn)部分生長抑由于此原因，24h讀數(shù)是標(biāo)準(zhǔn)的，生長較慢的新型隱球?qū)τ谌庋叟卸∕IC，宜使用反光鏡讀取裝置從底部一面檢查微量板的各孔?？梢宰C實讀取終點前輕輕搖動微量板中的生長物有所幫助。對于氟胞嘧啶、唑類藥物、棘白菌素類藥物，將孔中生性生長對照比較，MIC記錄為該藥物相比于對照顯著抑制（至少50%）生長的最低濃度。對于兩性霉取。培養(yǎng)基對照孔的背景讀數(shù)宜從其他各孔讀數(shù)中減掉。對于氟胞嘧啶、唑類藥物、棘白菌素類藥物，MIC記錄為該藥物相比于對照顯著抑制（至少50%）生長的最低濃度。對于兩性霉素B，MIC是相本文件任何一種途徑給出MIC結(jié)果的臨床解釋宜依度法讀取確定的MIC解釋宜使用來自EUCAST最新指南[17]試驗結(jié)果的質(zhì)量通過伴隨使用的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株（見表4和表5）來監(jiān)測。貯存質(zhì)控菌株宜凍干或在-60℃或低于-60℃冷凍保存。質(zhì)控菌株的使用未經(jīng)處理的稀釋板和處理過的稀釋板的質(zhì)量控制范圍已顯示為相似，對近平滑念珠菌ATCC?22019和克柔念珠菌ATCC?6258這兩株已用于所有國際質(zhì)量控范圍。這些范圍與肉眼判讀產(chǎn)生的范圍相似，但往往比目測低一個log2稀釋度。使用經(jīng)處理的稀在世界某些地區(qū)，某些抗真菌藥物-酵母霉菌屬使用了額外的質(zhì)量控制菌株（例如參考文獻[2]和近平滑念珠菌（Rezafungin）4.0-16（Rezafungin）讀（卡泊芬凈）的質(zhì)量控制范圍根據(jù)獨立的多實驗室按A.1概述拌,邊用1mol/L氫氧化鈉（NaOH）調(diào)節(jié)pH到7.0（25℃)。添加葡萄糖（取決于判讀方法）。加蒸餾L-天冬酰胺（無水）L-天冬氨酸L-胱氨酸·2HClL-谷氨酸L-谷氨酰胺甘氨酸L-組氨酸（游離堿）L-羥脯氨酸L-異亮氨酸L-亮氨酸L-賴氨酸·HClL-甲硫氨酸L-苯丙氨酸L-脯氨酸L-絲氨酸L-蘇氨酸L-色氨酸L-酪氨酸·2NaL-纈氨酸生物素D-泛酸氯化膽堿肌醇煙酰胺PABA(對氨基苯甲酸)鹽酸吡哆辛核黃素鹽酸硫胺氯化鉀硫酸鎂(無水)氯化鈉磷酸氫二鈉(無水)葡萄糖還原型谷胱甘肽酚紅鈉（含谷氨酰胺和酚紅，但不含碳酸氫鹽）用戶宜檢查供應(yīng)商提供的RPMI成分的濃度如上表所述。表A.2含0.2%葡萄糖和含2%葡萄糖RPMI-1640培養(yǎng)基成分（完整培養(yǎng)基）[2][5]2×濃度RPMI-1640aMOPSbb3-(N-嗎啡啉)丙磺酸，0.165mol/L終濃度。a)通過加0.5ml0.048mol/LBaCl2(1.175%w/vBaCl2×2H2O)到99.5ml0.18mol/LH2SO4(體積分?jǐn)?shù)b)用分光光度計用1cm光徑和匹配的比色杯測定濁度標(biāo)準(zhǔn)吸光度來驗證其光密度正確性。0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)在625nm吸光度宜在0.08~c)分裝4mL~6mL到用于生長或稀釋肉湯培養(yǎng)接種物的相同規(guī)格螺口管中。e)臨用前在機械渦旋混合器上強力搖勻此濁[1]CLSIM27-A3,ReferenceMethodforBrothDilutionAntifuconcentrationsofantifungalagentsstandardmethodssetforthbyFungiUsingtheMethodsofEuropeanCommitteeonAntimicrobialHydrophilicandHydrop[7]Arthington-SkaggsBresultsandinvcandidiasis.Antimicrob.AgentsChemother.2000,44pp.2081-2085(AFST)oftheESCMIDEuropeanCommitteedilutionminimuminhibitoryconcent