GB∕ T 40392-2021 循環(huán)冷卻水中軍團(tuán)菌的檢測(cè)（正式版）

ICS13.060.70;13.060.25GB/T40392—2021循環(huán)冷卻水中軍團(tuán)菌的檢測(cè)DetectionofLegionellaincirculatingcoolingwater(ISO11731:2017,Waterquality—EnumerationofLegionella,NEQ)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局發(fā)布國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)IGB/T40392—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中國(guó)石油和化學(xué)工業(yè)聯(lián)合會(huì)提出。本文件由全國(guó)化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)水處理劑分技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC63/SC5)歸口。華測(cè)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)股份有限公司、中海油天1GB/T40392—2021循環(huán)冷卻水中軍團(tuán)菌的檢測(cè)1范圍本文件規(guī)定了循環(huán)冷卻水中軍團(tuán)菌的檢測(cè)方法。菌的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文本文件。GB/T6682—2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)GB/T27405實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品微生物檢測(cè)GB/T27405界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1軍團(tuán)菌Legionella鹽緩沖液的活性炭-酵母提取液(BCYE)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的特性。3.2嗜肺軍團(tuán)菌Legionellapneumophila;Lp4通則本文件規(guī)定的檢測(cè)應(yīng)符合GB/T27403并應(yīng)在二級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室(BSL-2)內(nèi)完成，檢出軍團(tuán)菌的樣品及培養(yǎng)基應(yīng)經(jīng)過(guò)無(wú)害化處理。2GB/T40392—2021循環(huán)冷卻水中軍團(tuán)菌數(shù)目一般達(dá)不到直接涂布檢測(cè)的數(shù)目(10?CFU/L),應(yīng)通過(guò)膜過(guò)濾濃縮水樣提取液培養(yǎng)基(BCYE培養(yǎng)基)生長(zhǎng)而在L-半胱氨酸缺失的BCYE培養(yǎng)基(BCYE-Cys培養(yǎng)基)不生長(zhǎng)6.1無(wú)菌水：應(yīng)符合GB/T6682—2008中三級(jí)水的規(guī)定，于121℃±1℃高6.4L-半胱氨酸缺失的BCYE培養(yǎng)基(BCYE-Cys培養(yǎng)基):按A.2制備或采用市售成品。6.5選擇性培養(yǎng)基(GVPC培養(yǎng)基):按A.3制備或采用市售成品。7.2真空泵。7.4無(wú)菌涂布器。7.8無(wú)菌接種環(huán)：直徑為3mm。2℃~8℃的冷藏條件下存儲(chǔ)或運(yùn)輸，最好在2d內(nèi)檢測(cè)，最長(zhǎng)不應(yīng)超過(guò)14d。3GB/T40392—20219.1樣品預(yù)處理水樣中含有雜質(zhì)時(shí)可靜置沉淀或1000r/min離心1min,取上清液備用。在真空過(guò)濾系統(tǒng)上安裝微孔濾膜，取水樣上清液200mL～1000mL過(guò)濾，記錄過(guò)濾水樣的體積振蕩至少2min(也可將容器放入超聲波振蕩器中振蕩2min～10min,稀釋液液面應(yīng)低于超聲波振蕩當(dāng)樣品中軍團(tuán)菌的菌落數(shù)量超過(guò)10?CFU/L時(shí)，可不進(jìn)行樣品濃縮處理，計(jì)數(shù)時(shí)按直接涂布法計(jì)數(shù)。9.2樣品制備9.2.1將9.1.2的濃縮液(無(wú)需濃縮時(shí)取原液)分成三份。其中一份不做處理，另兩份分別采用熱處理9.2.2熱處理：移取1.0mL濃縮液(或原液)于一無(wú)菌容器中，置于50℃±1℃的水浴中加熱30min。為2.2,放置5min。9.3接種接種液均勻涂布于相對(duì)應(yīng)的GVPC培養(yǎng)基平皿的整個(gè)表面。9.4培養(yǎng)將已接種的平板倒置放入CO?培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)CO?濃度為2.5%,溫度為36℃±1℃,相對(duì)濕度不小于95%,培養(yǎng)10d。9.5檢查平板量。在平板上生長(zhǎng)小于300個(gè)菌落為宜，如有大量軍團(tuán)菌生長(zhǎng)，則應(yīng)減少過(guò)濾樣品的體積或稀釋濃縮液。軍團(tuán)菌的生長(zhǎng)可能被其他菌掩蓋或抑制，如果懷疑軍9.6菌落驗(yàn)證在GVPC培養(yǎng)基上2d內(nèi)生長(zhǎng)的菌落均不是軍團(tuán)菌。從GVPC培養(yǎng)基上選擇3d～10d內(nèi)生長(zhǎng)的疑似軍團(tuán)菌菌落分別接種到BCYE和BCYE-Cys兩塊培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。如果有不同類型的疑似軍4GB/T40392—2021驗(yàn)證。將疑似菌落在含2.5%CO?的培養(yǎng)箱中36℃±1℃培養(yǎng)2d。凡在BCYE上生長(zhǎng)而在BCYE-Cys上不生長(zhǎng)的被確認(rèn)為軍團(tuán)菌菌落，記錄每個(gè)平板的結(jié)果。如需計(jì)數(shù)時(shí)，計(jì)算確認(rèn)的軍團(tuán)菌菌落數(shù)N?占從培養(yǎng)基上挑取的疑似軍團(tuán)菌菌落數(shù)量N的比例。9.7嗜肺軍團(tuán)菌的鑒定在常規(guī)監(jiān)測(cè)中可不進(jìn)行嗜肺軍團(tuán)菌的鑒定，在軍團(tuán)菌疾病暴發(fā)時(shí)或有疑似病例時(shí)應(yīng)進(jìn)行嗜肺軍團(tuán)菌的鑒定。取BCYE培養(yǎng)基上經(jīng)確證的軍團(tuán)菌菌落按附錄B進(jìn)行鑒定。10軍團(tuán)菌的計(jì)數(shù)10.1直接涂布法水樣中軍團(tuán)菌的計(jì)數(shù)以每升樣品中的菌落數(shù)X計(jì)，單位為菌落形成單位每升(CFU/L),按公式(1)計(jì)算：…………a——GVPC培養(yǎng)基上疑似軍團(tuán)菌的菌落數(shù)，單位為菌落形成單位(CFU);N?——確認(rèn)的軍團(tuán)菌菌落數(shù)，單位為菌落形成單位(CFU);N——培養(yǎng)基上挑取的疑似軍團(tuán)菌菌落數(shù)，單位為菌落形成單位(CFU);V——接種的原液的體積的數(shù)值，單位為毫升(mL)(原液、熱處理樣品：V=0.1;酸處理樣品：V=0.05)。10.2濃縮法水樣中軍團(tuán)菌的計(jì)數(shù)以每升樣品中的菌落數(shù)X計(jì)，單位為菌落形成單位每升(CFU/L),按公式(2)計(jì)算：…………式中：a—-GVPC培養(yǎng)基上疑似軍團(tuán)菌的菌落數(shù)，單位為菌落形成單位(CFU);N?———確認(rèn)的軍團(tuán)菌菌落數(shù)，單位為菌落形成單位(CFU);N———培養(yǎng)基上挑取的疑似軍團(tuán)菌菌落數(shù)，單位為菌落形成單位(CFU);V。——量取的無(wú)菌水的體積的數(shù)值，單位為毫升(mL)(V.=15.0);V—種的濃縮液的體積的數(shù)值，單位為毫升(mL)(未經(jīng)處理的濃縮液樣品、熱處理樣品V=0.1;酸處理樣品V=0.05);10.3結(jié)果計(jì)算分別對(duì)未經(jīng)處理、熱處理和酸處理樣品接種后培養(yǎng)出的軍團(tuán)菌的數(shù)量按照公式(1)或公式(2)進(jìn)行計(jì)算，取結(jié)果的最大值作為該水樣中軍團(tuán)菌的數(shù)量X,此數(shù)值為此份樣品中軍團(tuán)菌的最大可能數(shù)。5GB/T40392—202111試驗(yàn)報(bào)告團(tuán)菌的數(shù)量X(CFU/L)。6GB/T40392—2021A.1活性炭-酵母提取液培養(yǎng)基(BCYE培養(yǎng)基)A.1.1成分活性炭水A.1.2.1半胱氨酸和焦磷酸鐵的溶解2.0g2.8gA.1.2.2ACES緩沖液將ACES顆粒加入到500mL水中，于45℃~50℃水浴溶解。另取480mL水溶解氫氧化鉀，輕A.1.2.3最終調(diào)節(jié)KOH溶液或0.1mol/LH?SO?溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8±0.2。加入瓊脂，混合均勻后于121℃±1℃高壓蒸氣滅菌15min。滅菌后用冷水浴冷卻至50℃左右，加入溶解好的L-半胱氨酸鹽酸鹽溶液和焦磷讓平皿上的多余水分干燥，在2℃~8℃下于密封容器中避光儲(chǔ)存1個(gè)月。A.3選擇性培養(yǎng)基(GVPC培養(yǎng)基)7多粘菌素B(PolymyxinBsulfate)80000IU/L萬(wàn)古霉素鹽酸鹽(Vancomycinhydrochloride)納他霉素(Natamycin)可代替放線菌酮。A.3.2抗生素添加劑的制備于-25℃～-15℃保存。使用時(shí)，放至室溫后再用。按照BCYE培養(yǎng)基的制備方法(A.1.2)進(jìn)行配制，在加入α-酮戊二酸單鉀鹽后，再加入3g甘氨酸后調(diào)節(jié)pH值為6.8±0.2。在加入溶解后的L-半胱氨酸和焦磷酸鐵后，再加入三種抗生素添加劑(A.3.2),混勻。A.4酸緩沖液A.4.1成分鹽酸氯化鉀A.4.2制備A.4.2.1溶液A:0.2mol/L鹽酸mol/Lmol/LA.4.2.2溶液B:0.2mol/L氯化鉀將14.9g氯化鉀溶解于1L水中，于121℃±1℃高壓蒸汽滅菌15min。A.4.2.3酸緩沖液的玻璃瓶中，該溶液在室溫下避光放置不超過(guò)1個(gè)月。8GB/T40392—2021A.5氧化酶試劑A.5.1成分四甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽水A.5.2制法使用前迅速將上述成分溶于水中。A.6硝酸鹽培養(yǎng)基A.6.1成分硝酸鉀蛋白水A.6.2制法溶解，調(diào)節(jié)pH值至7.40,分裝試管，每管約5mL,于121℃±1℃高壓蒸汽滅菌15min。A.6.3硝酸鹽還原試劑A.6.3.2乙液：將甲萘胺0.5g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中。A.7尿素瓊脂A.7.1成分蛋白胨氯化鈉葡萄糖磷酸二氫鉀0.4%酚紅溶液瓊脂水20%尿素溶液20gA.7.2制法將除尿素和瓊脂以外的成分配好，并校正pH值，加入瓊脂，加熱溶化并分裝燒瓶，于121℃±1℃高壓滅菌15min。冷卻至50℃~55℃,加入經(jīng)除菌過(guò)濾的尿素溶液。尿素的最終濃度應(yīng)為2%,最終pH值應(yīng)為7.2±0.1。分裝于滅菌試管內(nèi)，放成斜面?zhèn)溆谩.8營(yíng)養(yǎng)明膠A.8.1成分9A.8.2制法GB/T40392—2021gmL加熱溶解、校正至pH值7.4～7.6,分裝小管，于121℃±1℃高壓蒸汽滅菌10min,取出后迅速冷卻，使其凝固，最終pH值應(yīng)為6.8～7.0。A.9馬尿酸水解試劑A.9.11%馬尿酸鈉溶液A.9.1.1成分馬尿酸鈉1.0gA.9.1.2制法將馬尿酸鈉溶于水中，在121℃±1℃高壓蒸汽滅菌15min,避光保存。A.9.23.5%(水合)茚三酮溶液A.9.2.1成分(水合)茚三酮(ninhydrin)1.75g丁醇25mLA.9.2.2制法將(水合)茚三酮溶解于丙酮/丁醇混合液中。該溶液避光冷藏，最多不超過(guò)7d。GB/T40392—2021B.1總則B.2試劑或材料B.2.1軍團(tuán)菌膠乳凝集試劑盒，市售。B.2.4硝酸鹽培養(yǎng)基：按A.6制備或采用市售成品。B.2.7馬尿酸水解試劑：按A.9制備或采用市售成品。B.3生化培養(yǎng)法判定嗜肺軍團(tuán)菌B.3.4尿素酶試驗(yàn)：將待檢菌以較大量穿刺接種在尿素瓊脂培養(yǎng)基上，于36℃±1℃培養(yǎng)2h、4h、4℃±2℃冰箱內(nèi)10min～30min后再觀察結(jié)果。仍呈溶解狀或表面溶解時(shí)即為明膠液化試驗(yàn)陽(yáng)性；勻后于36℃±1℃水浴中溫育或36℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。沿著試管壁緩緩加入0.2mL茚三酮溶液，于36℃±1℃水浴中溫育或36℃±1℃培養(yǎng)箱中放置10min后觀察結(jié)果。15min內(nèi)溶液出GB/T40392—2021B.4血清型鑒定當(dāng)軍團(tuán)菌乳膠凝集試劑盒中的乳膠顆粒與含軍團(tuán)菌或者從相關(guān)的軍團(tuán)菌加熱滅活的抗原的懸液混B.4.2初篩用軍團(tuán)菌乳膠凝集試劑盒初篩血清型，觀察凝結(jié)結(jié)果，按表B.1將血清型分為L(zhǎng)pl單價(jià)、Lp2-14(15)多價(jià)和Lpspecies三種。表B.1與1