分子診斷應(yīng)用說明

封面一（深色底）

本案主題標(biāo)題文字為28號(hào)方正蘭亭粗黑簡體

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2012年9月12日

CNAS-CL36醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明

2012年09月13日發(fā)布,2014年04月21日第1次修訂,

2014年11月01日實(shí)施前言本文件由中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）制定，是CNAS根據(jù)分子診斷領(lǐng)域的特性而對CNAS-CL02：2012《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》所作的進(jìn)一步說明，并不增加或減少該準(zhǔn)則的要求。本文件與CNAS-CL02：2012《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》同時(shí)使用。在結(jié)構(gòu)編排上，本文件章、節(jié)的條款號(hào)和條款名稱均采用CNAS-CL02：2012中章、節(jié)條款號(hào)和名稱，對CNAS-CL02：2012應(yīng)用說明的具體內(nèi)容在對應(yīng)條款后給出。

范

圍本文件規(guī)定了CNAS對分子診斷領(lǐng)域的認(rèn)可要求，包括：病原體核酸和人體基因等領(lǐng)域涉及的:1.核酸擴(kuò)增試驗(yàn);2.雜交試驗(yàn)（包括原位雜交試驗(yàn)）;3.核酸電泳分析等。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括修改單）適用于本文件。1.GB/T20468-2006臨床實(shí)驗(yàn)室定量測定室內(nèi)質(zhì)量控制指南2.CNAS-RL02能力驗(yàn)證規(guī)則3.CNSA-CL31內(nèi)部校準(zhǔn)要求4.臨床技術(shù)操作規(guī)范·病理學(xué)分冊，人民軍醫(yī)出版社，20045.醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則6.病理科建設(shè)與管理指南（試行），衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2009〕31號(hào)4.1組織和管理責(zé)任

實(shí)驗(yàn)室為獨(dú)立法人單位的，應(yīng)有醫(yī)療機(jī)構(gòu)執(zhí)業(yè)許可；實(shí)驗(yàn)室為非獨(dú)立法人單位的，其所屬醫(yī)療機(jī)構(gòu)執(zhí)業(yè)證書的診療科目中應(yīng)有醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，自獲準(zhǔn)執(zhí)業(yè)之日起，開展分子診斷工作至少2年。應(yīng)至少有1名具有副高及以上專業(yè)技術(shù)職務(wù)任職資格，從事分子診斷工作至少5年。5.1人員

5.1.2分子診斷實(shí)驗(yàn)室（以下簡稱實(shí)驗(yàn)室）負(fù)責(zé)人應(yīng)至少具有中級(jí)專業(yè)技術(shù)職稱、從事分子診斷工作至少3年。分子診斷實(shí)驗(yàn)室操作人員應(yīng)經(jīng)過有資質(zhì)的培訓(xùn)機(jī)構(gòu)培訓(xùn)合格取得上崗證后方可上崗。簽發(fā)分子病理報(bào)告的醫(yī)師應(yīng)至少具有中級(jí)病理學(xué)專業(yè)技術(shù)職務(wù)任職資格，并有從事分子病理工作的經(jīng)歷。認(rèn)可的授權(quán)簽字人應(yīng)至少具有中級(jí)專業(yè)技術(shù)職務(wù)任職資格，從事申請認(rèn)可授權(quán)簽字領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)工作至少3年。5.1.3實(shí)驗(yàn)室應(yīng)至少具有2名檢驗(yàn)/檢查人員。5.1.6應(yīng)每年評(píng)估員工的工作能力。對新進(jìn)員工在最初6個(gè)月內(nèi)應(yīng)至少進(jìn)行2次能力評(píng)審，保存評(píng)估記錄。當(dāng)職責(zé)變更時(shí)，或離崗6個(gè)月以上再上崗時(shí)，或政策、程序、技術(shù)有變更時(shí)，應(yīng)對員工進(jìn)行再培訓(xùn)和再評(píng)估，合格后才可繼續(xù)上崗，并記錄。5.2設(shè)施和環(huán)境條件5.2.1應(yīng)實(shí)施安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，如果設(shè)置了不同的控制區(qū)域，應(yīng)制定針對性的防護(hù)措施及合適的警告。5.2.2涉及基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室原則上分四個(gè)獨(dú)立的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)；樣品制備區(qū)；擴(kuò)增區(qū)；擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。如使用自動(dòng)分析儀（擴(kuò)增產(chǎn)物閉管檢測），擴(kuò)增區(qū)和擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。具體實(shí)驗(yàn)室分區(qū)應(yīng)依據(jù)其所使用的技術(shù)平臺(tái)及檢驗(yàn)項(xiàng)目和工作量而定。上述每個(gè)區(qū)域應(yīng)有充足空間以保證：-樣品處置符合分析前、后樣品分區(qū)放置；-儀器放置符合維修和操作要求；-樣品制備區(qū)放置生物安全柜、離心機(jī)和冰箱等儀器設(shè)備；-打印檢驗(yàn)報(bào)告時(shí)交叉污染的控制。工作區(qū)域應(yīng)符合如下要求：c）實(shí)驗(yàn)室各分區(qū)應(yīng)配置固定和移動(dòng)紫外線燈，波長為254nm，照射時(shí)離實(shí)驗(yàn)臺(tái)的高度一般為60～90cm；e）樣品制備區(qū)應(yīng)配置二級(jí)生物安全柜和洗眼器，實(shí)驗(yàn)室附近應(yīng)有噴淋裝置。所有分子病理實(shí)驗(yàn)室均應(yīng)設(shè)置獨(dú)立的標(biāo)本前處理區(qū)，包括切片區(qū)和脫蠟區(qū)，用于組織切片、脫蠟、水化、染色等。脫蠟、水化及染色應(yīng)在通風(fēng)設(shè)施中進(jìn)行。5.2.3用以保存臨床樣品和試劑的設(shè)施應(yīng)設(shè)置目標(biāo)溫度和允許范圍，并記錄。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有溫度失控時(shí)的處理措施并記錄。5.2.6不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。工作結(jié)束后應(yīng)立即對工作區(qū)進(jìn)行清潔，必要時(shí)進(jìn)行消毒及去污染。應(yīng)依據(jù)所用分析設(shè)備和實(shí)驗(yàn)過程的要求，制定環(huán)境溫濕度控制要求并記錄。應(yīng)有溫濕度失控時(shí)的處理措施并記錄。擴(kuò)增儀應(yīng)配備不間斷電源（UPS）；應(yīng)依據(jù)用途（如：RNA檢測用水），制定適宜的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（如：應(yīng)除RNase），并定期檢測。分子檢驗(yàn)各工作區(qū)域應(yīng)有明確的標(biāo)記。進(jìn)入基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室各工作區(qū)應(yīng)按照單一方向進(jìn)行，即試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→樣品制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。不同的工作區(qū)域宜使用不同的工作服（如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時(shí)，不應(yīng)將工作服帶出。5.3實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、試劑和耗材

如從事RNA檢測，宜配備－70℃的冷凍設(shè)備。需要時(shí)，配備高速冷凍離心機(jī)。標(biāo)本制備區(qū)使用的一次性加樣器吸頭應(yīng)帶有濾芯。PCR試驗(yàn)用容器應(yīng)可密閉，不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不能混用。組織標(biāo)本前處理區(qū)的設(shè)備通常應(yīng)包括切片機(jī)、裱片機(jī)、切片刀、電熱恒溫箱、脫蠟缸、水化缸及HE染色缸等。

應(yīng)按國家法規(guī)要求對強(qiáng)檢設(shè)備進(jìn)行檢定。應(yīng)進(jìn)行外部校準(zhǔn)的設(shè)備，如果符合檢測目的和要求，可按制造商校準(zhǔn)程序進(jìn)行。應(yīng)至少對分析設(shè)備的加樣系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和溫控系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)（適用時(shí)）。分析設(shè)備和輔助設(shè)備的內(nèi)部校準(zhǔn)應(yīng)符合CNAS-CL31《內(nèi)部校準(zhǔn)要求》。應(yīng)定期對基因擴(kuò)增儀、加樣器、溫度計(jì)、恒溫設(shè)備、離心機(jī)和生物安全柜等進(jìn)行校準(zhǔn)。設(shè)備故障后，應(yīng)首先分析故障原因，如果設(shè)備故障可能影響了方法學(xué)性能，故障修復(fù)后，可通過以下合適的方式進(jìn)行相關(guān)的檢測、驗(yàn)證：（a）可校準(zhǔn)的項(xiàng)目實(shí)施校準(zhǔn)驗(yàn)證，必要時(shí)，實(shí)施校準(zhǔn)；（b）質(zhì)控物檢驗(yàn)；（c）與其他儀器或方法比對，偏差符合附錄A.3的要求；（d）以前檢驗(yàn)過的樣品再檢驗(yàn)，偏差符合附錄A.5的要求。

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立試劑和關(guān)鍵耗材（如離心管、帶濾芯的吸頭）的驗(yàn)收程序，相應(yīng)程序中應(yīng)有明確的判斷符合性的方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（宜參考附錄A）。

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對新批號(hào)或同一批號(hào)不同貨運(yùn)號(hào)的試劑和關(guān)鍵耗材進(jìn)行驗(yàn)收，驗(yàn)收試驗(yàn)至少應(yīng)包括：（a）外觀檢查：肉眼可看出的，如包裝完整性、有效期等；（b）性能驗(yàn)證：通過實(shí)驗(yàn)才能判斷的，如試劑的核酸提取效率和核酸擴(kuò)增效率、試劑的批間差異、關(guān)鍵耗材的抑制物等。試劑性能驗(yàn)證記錄應(yīng)能反映該批試劑的核酸提取效率和核酸擴(kuò)增效率。一般情況下，臨床實(shí)驗(yàn)室在新批號(hào)試劑或關(guān)鍵耗材使用前，應(yīng)驗(yàn)證試劑批間差異和耗材的抑制物，符合附錄A.6要求即可視為滿足要求。特殊情況下，如實(shí)驗(yàn)室懷疑提取試劑有質(zhì)量問題，可采用凝膠電泳試驗(yàn)比較核酸提取物與核酸標(biāo)準(zhǔn)物確認(rèn)核酸片段提取的完整性、260nm紫外波長測定確認(rèn)核酸提取的產(chǎn)率、260nm/280nm比值確認(rèn)核酸提取的純度。用于定性檢驗(yàn)的試劑，選擇陰性和弱陽性的樣品進(jìn)行試劑批號(hào)驗(yàn)證。用于定量檢驗(yàn)的試劑，應(yīng)進(jìn)行新舊試劑批間的差異驗(yàn)證，方法和要求參照附錄A.6要求。耗材的抑制物驗(yàn)收：對關(guān)鍵耗材應(yīng)檢測是否存在核酸擴(kuò)增的抑制物，方法和要求參照附錄A.6要求。5.4檢驗(yàn)前過程

應(yīng)規(guī)定分子診斷樣品留取的具體要求，如：（a）使用無DNase和/或無RNase的一次性密閉容器；（b）正確使用抗凝管：通常全血和骨髓樣品應(yīng)進(jìn)行抗凝處理，EDTA和枸櫞酸鹽為首選抗凝劑，不使用肝素抗凝（核酸提取采用吸附法而不受肝素干擾時(shí)除外）；（c）用于RNA（如HCVRNA）擴(kuò)增檢測的血樣品宜進(jìn)行抗凝處理，并盡快分離血漿，以避免RNA的降解；如未作抗凝處理，則宜盡快分離血清。（d）分泌物、拭子、腫瘤組織等樣品留取的注意事項(xiàng)等。5.4.6e)基于組織/細(xì)胞學(xué)形態(tài)基礎(chǔ)的分子檢測項(xiàng)目應(yīng)由具有病理診斷資質(zhì)的醫(yī)師確認(rèn)樣品是否滿足檢測要求。5.4.7樣品應(yīng)盡快處置并以適當(dāng)方式儲(chǔ)存，以盡可能減少核酸降解。超長期儲(chǔ)存后的標(biāo)本，使用前應(yīng)再次評(píng)估標(biāo)本的完整性。檢測樣品若為組織，應(yīng)采用10%中性緩沖的福爾馬林固定，固定液的量和固定時(shí)間應(yīng)符合檢測要求。

檢驗(yàn)過程定量檢測方法和程序的分析性能驗(yàn)證內(nèi)容至少應(yīng)包括精密度、正確度、線性、測量和/或可報(bào)告范圍、抗干擾能力等。定性檢測項(xiàng)目驗(yàn)證內(nèi)容至少應(yīng)包括測定下限、特異性、準(zhǔn)確度（方法學(xué)比較或與金標(biāo)準(zhǔn)比較）、抗干擾能力等。驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)經(jīng)過授權(quán)人審核。應(yīng)使用驗(yàn)證過的核酸抽提和純化方法，必要時(shí)進(jìn)行核酸定量。對產(chǎn)前檢驗(yàn)，在完成分子診斷前應(yīng)保留備份培養(yǎng)物并跟蹤監(jiān)測實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性；在檢驗(yàn)胎兒標(biāo)本前，應(yīng)檢驗(yàn)父母一方或雙方的突變狀態(tài)，宜由同一實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)；如有足夠的標(biāo)本，應(yīng)從兩份不同標(biāo)本中提取DNA進(jìn)行雙份檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)了解檢驗(yàn)方法受母體細(xì)胞污染的影響，應(yīng)有程序評(píng)估并減少這種影響。應(yīng)有明確和統(tǒng)一的原位雜交（ISH）陽性信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)，并建立本實(shí)驗(yàn)室的陽性閾值。組織病理ISH，應(yīng)結(jié)合組織形態(tài)進(jìn)行結(jié)果判讀，并采用國際通用的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。5.6檢驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量的保證應(yīng)制定室內(nèi)質(zhì)量控制程序，定量測定可參照GB/T20468-2006《臨床實(shí)驗(yàn)室定量測定室內(nèi)質(zhì)量控制指南》。質(zhì)量控制程序中應(yīng)有針對核酸檢測防污染的具體措施。應(yīng)保留DNA質(zhì)量評(píng)價(jià)記錄。需要時(shí)，應(yīng)對RNA的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，并選擇合適的“管家”mRNA作為內(nèi)對照以評(píng)價(jià)所提取RNA的完整性，并保留RNA質(zhì)量評(píng)價(jià)記錄及假陰性率監(jiān)測記錄。對用于基因突變檢測的石蠟包埋樣品，應(yīng)有病理醫(yī)師從組織形態(tài)學(xué)對腫瘤細(xì)胞的存在與否及其數(shù)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，并決定是否需要對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行富集。當(dāng)分子診斷結(jié)果與臨床和其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符時(shí)，應(yīng)記錄并分析原因，適當(dāng)時(shí)采取糾正措施。

質(zhì)控物定性檢測項(xiàng)目，每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陰性、弱陽性和/或陽性質(zhì)控物。如為基因突變、基因多態(tài)性或基因型檢測，則應(yīng)包括最能反映檢測情況的突變或基因型樣品，每批檢測的質(zhì)控至少應(yīng)有一種基因突變或基因型。定量檢測項(xiàng)目，每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陰性、弱陽性和陽性質(zhì)控物。

質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)質(zhì)控規(guī)則應(yīng)確保試驗(yàn)的穩(wěn)定性和檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。定量檢測項(xiàng)目質(zhì)控圖應(yīng)包括質(zhì)控結(jié)果、質(zhì)控物名稱、濃度、批號(hào)和有效期、質(zhì)控圖的中心線和控制界線、分析儀器名稱和唯一標(biāo)識(shí)、方法學(xué)名稱、檢驗(yàn)項(xiàng)目名稱、試劑和校準(zhǔn)物批號(hào)、每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的日期和時(shí)間、干擾行為的記錄、質(zhì)控人員及審核人員的簽字、失控時(shí)的分析處理程序和糾正措施等。定性檢測項(xiàng)目：陰陽性符合預(yù)期。

應(yīng)按照CNAS-RL02《能力驗(yàn)證規(guī)則》的要求參加相應(yīng)的能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評(píng)。應(yīng)保留參加能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評(píng)的結(jié)果和證書。實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人或指定人員應(yīng)監(jiān)控室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)的結(jié)果，并在結(jié)果報(bào)告上簽字。

通過與其他實(shí)驗(yàn)室（如已獲認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室、使用相同檢測方法的實(shí)驗(yàn)室、使用配套系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室）比對的方式確定檢驗(yàn)結(jié)果的可接受性時(shí)，應(yīng)滿足如下要求：（a）規(guī)定比對實(shí)驗(yàn)室的選擇原則；（b）樣品數(shù)量：至少5份，包括正常和異常水平或不同常見基因突變或基因型；（c）頻率：至少每年2次；（d）判定標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)有≥80%的結(jié)果符合要求。5.6.4實(shí)驗(yàn)室使用兩套及以上檢測系統(tǒng)檢測同一項(xiàng)目時(shí)，應(yīng)有比對數(shù)據(jù)表明其檢測結(jié)果的一致性，比對頻次每年至少1次，樣品數(shù)量不少于20，濃度水平應(yīng)覆蓋測量區(qū)間；應(yīng)定期（至少每年1次，每次至少5份臨床樣品）進(jìn)行檢驗(yàn)人員的結(jié)果比對、考核并記錄。比對結(jié)果應(yīng)符合附錄A的要求。使用不同生物參考區(qū)間的檢測系統(tǒng)間不宜進(jìn)行比對。比對記錄應(yīng)由實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人審核并簽字，并應(yīng)保留至少2年。5.7檢驗(yàn)后過程5.7.2原始樣品、核酸提取物和/或核酸擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)規(guī)定保存期，便于復(fù)查。為便于追溯，凝膠圖像和斑點(diǎn)雜交條帶和/或通過掃描、拍照等方式保留的結(jié)果應(yīng)作為技術(shù)記錄保存，保存期限參照相關(guān)行業(yè)要求。5.8結(jié)果報(bào)告5.8.3除了通用要求外，適用時(shí)，分子診斷報(bào)告內(nèi)容還應(yīng)包括方法的局限性、進(jìn)一步檢測的建議、相關(guān)咨詢?nèi)藛T姓名及聯(lián)系方式。5.9結(jié)果發(fā)布5.10實(shí)驗(yàn)室信息管理

附錄A（規(guī)范性附錄）

分子診斷項(xiàng)目分析性能標(biāo)準(zhǔn)

A.1應(yīng)不低于國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方法規(guī)要求。A.2自建檢測系統(tǒng)不精密度要求：以能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評(píng)評(píng)價(jià)界限（靶值±0.4對數(shù)值）作為允許總誤差（TEa），重復(fù)性精密度<3/5TEa；中間精密度<4/5TEa。A.3設(shè)備故障修復(fù)后，分析系統(tǒng)比對：5份樣品，覆蓋測量區(qū)間，至少4份樣品測量結(jié)果偏倚<±7.5%。A.4實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分析系統(tǒng)定期比對：樣品數(shù)n≥20，濃度應(yīng)覆蓋測量區(qū)間，計(jì)算回歸方程，系統(tǒng)誤差應(yīng)<±7.5%。A.5留樣再測判斷標(biāo)準(zhǔn)：按照項(xiàng)目穩(wěn)定性要求選取最長期限樣品，5個(gè)樣品，覆蓋測量區(qū)間，至少4個(gè)樣品測量結(jié)果偏倚<±7.5%。A.6試劑批間差異、耗材的抑制物的驗(yàn)收判斷標(biāo)準(zhǔn)：選取5個(gè)舊批號(hào)檢測過的樣品，覆蓋測量區(qū)間