GB∕ T 40194-2021 大麥條紋花葉病毒檢疫鑒定方法（正式版）

ICSCCS65.020.01大麥條紋花葉病毒檢疫鑒定方法國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會IGB/T40194—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由全國植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC271)提出并歸口。本文件起草單位：中國檢驗檢疫科學(xué)研究院、中華人民共和國福州海關(guān)。1大麥條紋花葉病毒檢疫鑒定方法本文件規(guī)定了大麥條紋花葉病毒的血清學(xué)和分子生物學(xué)檢疫鑒定方法。本文件適用于可能帶有大麥條紋花葉病毒的植物及其產(chǎn)品的檢疫鑒定。本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4大麥條紋花葉病毒基本信息分類地位：馬泰利病毒目(Martellivirales)植物桿狀病毒科(Virgaviridae)大麥病毒屬(Hordei-大麥條紋花葉病毒的其他信息參見附錄A。5方法原理大麥條紋花葉病毒的血清學(xué)特性和基因組特征是該病毒檢疫鑒定的依據(jù)。根據(jù)BSMV與抗體之間的特異性反應(yīng)，對植物樣品進(jìn)行雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定(DAS-ELISA);依據(jù)BSMV的基因組特征進(jìn)行RT-PCR、實時熒光RT-PCR檢測；通過這些方法的有效組合，判斷樣品是否帶有BSMV。2GB/T40194—20216.1.4普通冰箱。6.1.5超低溫冰箱(-80℃)。6.1.6制冰機。6.1.7渦旋振蕩器。6.1.9高壓滅菌鍋。6.1.11超凈工作臺。6.1.12實時熒光定量PCR儀。6.1.14微波爐。6.1.15電泳儀。6.1.16電泳槽。6.1.17凝膠成像分析儀。6.1.18洗板機。6.1.19酶標(biāo)儀。6.1.20酶聯(lián)板。6.1.22可調(diào)移液器頭。6.1.23Eppendorf管。6.1.25微型磨杵。6.2.3實時熒光RT-PCR檢測試劑，制備按附錄D中D.1執(zhí)行。挑取畸形、不成熟種子播于滅菌土中，待長出3片～4片葉后將表現(xiàn)癥狀的植株編號；未表現(xiàn)癥狀的植株分組(10株為1組)并編號，采集的未表現(xiàn)癥狀的葉片分成2份；用于酶聯(lián)測定和分子生物學(xué)檢7.3植物產(chǎn)品3GB/T40194—2021組編號，分組方法和檢測方法同7.1。8檢測鑒定8.1雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定包被抗體后，再把制備的樣品上清液加入已包被BSMV抗體的酶聯(lián)板中，進(jìn)行DAS-ELISA檢測。每個樣品平行加到兩個孔中。健康的植物組織作為陰性對照，感染BSMV的植物組織作為陽性對照，樣品提取緩沖液作為空白對照；其中陰性對照的植物種類和材料(如葉片)應(yīng)盡量與檢測樣品相一致。具體操作按B.2的規(guī)定執(zhí)行。8.2RT-PCR檢測RT-PCR檢測的陰性和陽性對照設(shè)置同8.1,滅菌雙蒸水作為空白對照。分別提取樣品和對照的總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行PCR檢測，具體操作按C.2的規(guī)定執(zhí)行。如采用商品化一步法試劑8.3實時熒光RT-PCR檢測實時熒光RT-PCR檢測的陰性和陽性對照設(shè)置同8.1,滅菌雙蒸水作為空白對照。分別提取樣品和對照的總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行實時熒光PCR檢測，具體操作按D.2和D.3的規(guī)定執(zhí)行。如采用商品化一步法試劑盒，則按照試劑盒說明進(jìn)行。9結(jié)果判定DAS-ELISA、RT-PCR和熒光RT-PCR檢測方法按照B.3、C.3、D.4的判定方法進(jìn)行判定，其中任意兩種檢測方法的結(jié)果為陽性即可判定樣品攜帶BSMV。10樣品保存與結(jié)果記錄經(jīng)檢測確定攜帶BSMV的樣品應(yīng)保存在適合的條件下以備復(fù)核。如種子保存在干燥室溫環(huán)境中；種苗、葉片等樣品保存在超低溫冰箱(-80℃)中；做好登記和標(biāo)記工作，保存期限至少1年。10.2結(jié)果記錄聯(lián)反應(yīng)數(shù)值；RT-PCR檢測應(yīng)有電泳圖片；實時熒光RT-PCR檢測應(yīng)有熒光曲線圖。4GB/T40194—2021(資料性)A.1寄主范圍寄主范圍有限，自然寄主主要為大麥(Hordeumvulgare)、栽培二棱大麥(H.distichon)、小麥A.2危害癥狀受侵染的大麥在三葉期時即出現(xiàn)褐色分散的細(xì)小斑點，后逐漸增多引起葉片枯死。有的品種沿葉A.4傳播方式該病毒主要通過種子傳播，也可通過花粉傳播。種傳率分別為大麥90%～100%,小麥7%～81%,野燕麥22%,燕麥0～10%,長穗燕麥草22%,無芒燕麥8%,鴨跖草8%,玉米90%～100%,黑麥草屬A.5粒體形態(tài)病毒粒體為棒狀，長度在50nm～150nm,大多數(shù)為110nm;直徑約為20nm。A.6基因組基因組為正單鏈RNA,由三個組分組成，其中組分RNAα的長度約3.7kb,組分RNAβ的長度約5GB/T40194—2021(規(guī)范性)雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定(DAS-ELISA)B.1試劑B.1.1包被抗體特異性大麥條紋花葉病毒抗體。建議使用商品化試劑盒抗體；4℃保存不超過1年；抗體使用時的稀釋比例按說明書要求稀釋。B.1.2酶標(biāo)抗體堿性磷酸酯酶標(biāo)記的大麥條紋花葉病毒抗體。B.1.3底物對硝基苯磷酸二鈉(pNPP)。B.1.41×PBST緩沖液(pH7.4)氯化鈉(NaCl)磷酸二氫鉀(KH?PO?)磷酸氫二鈉(Na?HPO?)吐溫-20(Tween-20)加入900mL雙蒸水并用磁力攪拌器攪拌，用pH計調(diào)節(jié)至7.4,并定容至1000mL,4℃儲存。B.1.5樣品抽提緩沖液(pH7.4)亞硫酸鈉(Na?SO?)1.3g聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,MW24000-40000)20.0gB.1.6包被緩沖液(pH9.6)碳酸鈉(Na?CO?)1.59g碳酸氫鈉(NaHCO?)2.93g溶于900mL雙蒸水中，并定容至1000牛血清白蛋白(BSA)2.0g聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,MW24000—40000)20.0g溶于900mL1×PBST中，并用1×PBST定容至1000mL,4℃儲存。B.1.8底物緩沖液(pH9.8)二乙醇胺97mL6氯化鎂(MgCl?)B.2.1包被抗體按要求的濃度和需要的體積用包被緩沖液稀釋包被抗體，每孔加100μL。酶聯(lián)板加蓋或用保鮮膜再重復(fù)2次上述洗板過程。B.2.2樣品制備與加樣待測樣品、陰性對照及陽性對照按1:10(W/V)加入抽提緩沖液，在研缽中研磨；將樣品研磨液倒入離心管中，5000r/min離心10min,上清液即為制備好的檢測樣品。陰性對照、陽性對照也可以按試劑盒說明書進(jìn)行處理。按100μL/孔分別加入制備好的檢測樣品、陰性對照和陽性對照；酶聯(lián)板加蓋或用保鮮膜包好，4℃孵育過夜。酶聯(lián)板用自來水徹底沖洗，再用1×PBST洗滌3次，每次3min;或用洗板機自動清洗3次。B.2.3加酶標(biāo)抗體加蓋或用保鮮膜包好，37℃孵育4h。酶聯(lián)板用自來水徹底沖洗，再用1×PBST洗滌3次，每次3min;或用洗板機自動清洗3次。B.2.4加底物將底物pNPP加入到底物緩沖液中使終濃度為1mg/mL(現(xiàn)配現(xiàn)用),100μL/孔加入到酶聯(lián)板中，室溫避光孵育。B.2.5讀數(shù)在不同的時間內(nèi)如30min、60min、90min、120min或更長時間，用酶標(biāo)儀在405nm處讀OD值。B.3結(jié)果判定對照孔的OD4o5值(緩沖液孔、陰性對照及陽性對照孔)應(yīng)在質(zhì)量控制范圍內(nèi)，即：緩沖液孔和陰性對照孔的OD?o5值<0.15,當(dāng)陰性對照孔的OD4o?值<0.05時，按0.05計算；陽性對照孔的OD?5值/陰性對照OD?05值>5;同一樣品的重復(fù)性基本一致。B.3.2結(jié)果判定在滿足B.3.1的質(zhì)量控制要求后，結(jié)果原則上可判斷如下：樣品OD??5值/陰性對照OD??5值>2,判為陽性；樣品OD?o?值/陰性對照OD?o?值為2時，判為可疑樣品，需重新做一次，或用其他方法加以驗證；樣品OD?05值/陰性對照OD?05值<2,判為陰性。若不滿足B.3.1的質(zhì)量控制要求，則不能進(jìn)行結(jié)果判斷。7(規(guī)范性)Trizol或合格的RNA提取試劑盒。C.1.2電泳緩沖液TAE(50×)雙蒸水定容至1000mL,用時稀釋至1×TAE。C.2.1核酸提取用高速冷凍離心機4℃10min;4℃12000r/min離心10min,棄上清液；加入1mL75%的冷乙醇洗滌沉淀；4℃C.2.2引物序列上游引物BSMVF:5'-AGGATCAATGGGATACACAAGTT-3′下游引物BSMVR:5'-TTCGAAAGTCTTCCTGGTATACAC-3′C.2.3反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄總體系為20μL。0.2mLPCR管中加入總RNA1μL,dNTPs(10mmol/L)1μL,DEP5×buffer4μL,RNasin(40U/μL)1pL,M-MLV(200U/pL)1pL,42℃保溫1h,得到cDNA后用作C.2.4PCR擴增0.2mLPCR管中加入10×PCRbuffer(含Mg2+)2μL,dNTPs(10mmol/L)0.6μL,BSMVF及8GB/T40194—2021設(shè)置陽性對照、陰性對照及空白對照。試劑全部加入后將PCR管放置到PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。注：如采用商品化一步法RT-PCR檢測試劑盒，可按照說明書進(jìn)行操作，將步驟C.2.3和C.2.4合并進(jìn)行。C.2.5PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳用微波爐將瓊脂糖融化后制備1%的瓊脂糖凝膠并放入電泳槽，按比例混勻電泳上樣緩沖液和PCR擴增產(chǎn)物，用DNAMarker作為分子量標(biāo)記，用電泳儀進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后在凝膠成像分析儀C.3結(jié)果判定陽性對照在503bp左右處有條帶，陰性對照和空白對照無特異性條帶，待測樣品出現(xiàn)與陽性對照陽性對照在503bp左右處有條帶，陰性對照、空白對照及待測樣品無特異性條帶，可判定結(jié)果為9GB/T40194—2021(規(guī)范性)實時熒光RT-PCR檢測D.1試劑D.1.1核酸提取試劑同C.1.1。D.1.2TaqManOne-stepRT-PCRMixture。D.1.3引物探針：上游引物BSMVF:5'-CGGAATCGGTGTCGTTGGA-3'下游引物BSMVR:5'-CTCTTTGACCCGTCTCTGTAACTACC-3′探針BSMVP:5'-FAM-AAATCAAAAACATTCTACGGAATCCGG-TAMRA-3'。D.2核酸提取D.3實時熒光RT-PCR反應(yīng)反應(yīng)體系：0.2mL離心管中加入2×OneStepRT-PCR10μL,EnzymeMix0.6μL,BSMVF(10μmol/L)0.4