食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌與金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)方法

ICS07.100.30CCSICS07.100.30CCSC50團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/AHFSXXX-2024T/AHFSXXX-2024食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌與金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)方法（聚合酶螺旋反應(yīng)，PSR）RapidmethodforthedetectionofListeriamonocytogenesandStaphylococcusaureusinfoodstuffs(polymerasespiralreaction,PSR)202X-XX-XX實(shí)施202X-XX-XX實(shí)施202X-XX-XX發(fā)布安徽省食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)發(fā)布T/AHFSXXX-2024錯(cuò)誤！未定義樣式。前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第一部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件得結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。本文件由安徽國(guó)泰眾信檢測(cè)技術(shù)有限公司提出。本文件由安徽省食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)歸口管理。本文件起草單位：安徽國(guó)泰眾信檢測(cè)技術(shù)有限公司、南京財(cái)經(jīng)大學(xué)。本文件主要起草人：陸穎健、陳洪周、李琦、張莫然、龐心怡、孫靜、李向菲本文件為首次制定。食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌與金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)方法（聚合酶螺旋反應(yīng)，PSR）1范圍本文件規(guī)定了食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的聚合酶螺旋反應(yīng)快速檢測(cè)方法。本文件適用于食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.1食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則GB4789.10食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)GB4789.30食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1聚合酶螺旋反應(yīng)Polymerasespiralreaction(PSR）聚合酶螺旋反應(yīng)，簡(jiǎn)稱PSR，是一種新型恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。其原理是在2～4條特異性引物和具有鏈置換活性Bst-DNA聚合酶的作用下可在恒溫條件下完成對(duì)靶基因的快速擴(kuò)增，因具有引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、擴(kuò)增效率高且不需昂貴設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)而取得良好的應(yīng)用效果。其體系內(nèi)包含：Tris-HCl、硫酸銨、氯化鉀、硫酸鎂、Tween20、甜菜堿、dNTP、硫酸鎂、bstDNA聚合酶及特異性的兩對(duì)引物。檢測(cè)體積25μL，45min內(nèi)完成檢測(cè)，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。3.2縮略語下列縮略語適用于本文DNA：脫氧核糖核苷酸（deoxyribonucleicacid）dNTP：脫氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）Tris：三羥甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]HNB：羥基萘酚藍(lán)（hydroxynaphtholblue）4原理聚合酶螺旋反應(yīng)經(jīng)增菌提取DNA后，在體系內(nèi)加入1-2μLDNA，在恒溫65℃下反應(yīng)30-60min即可完成擴(kuò)增?；緮U(kuò)增原理為：在高濃度甜菜堿的作用下，誘導(dǎo)DNA單鏈和雙鏈之間處于動(dòng)態(tài)平衡。此外，利用BstDNA5'→3'聚合酶活性和鏈置換活性不斷使新合成的產(chǎn)物變性。隨后，允許引物與目標(biāo)片段結(jié)合，便于完成核酸擴(kuò)增。與其他恒溫核酸擴(kuò)增系統(tǒng)相比，PSR引物設(shè)計(jì)較為簡(jiǎn)單且為單酶系統(tǒng)，以此提高反應(yīng)穩(wěn)定性來簡(jiǎn)化過程。該法可以與羥基萘酚藍(lán)等顏色指示劑聯(lián)用，從而完成肉眼對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的判讀。羥基萘酚藍(lán)是一種金屬離子指示劑，可與反應(yīng)體系當(dāng)中的Mg2+結(jié)合而成紫羅蘭色，當(dāng)核酸大量合成時(shí)，從dNTPs析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)緩沖液中的鎂離子結(jié)合，生成焦磷酸鎂，失去鎂離子的羥基萘酚藍(lán)就變成了天藍(lán)色。5儀器與設(shè)備——冰箱：2-4℃、-20℃——培養(yǎng)箱：36℃——微型渦旋儀——超凈工作臺(tái)——超微量分光光度計(jì)——金屬浴加熱器——水平電泳儀——全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)——7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀——微量移液器：0.5-10μL、0.1-2.5μL、10-100μL6試劑與材料6.1質(zhì)控菌株表1質(zhì)控菌株序號(hào)菌株名稱拉丁文菌株編號(hào)1單增李斯特菌ListeriamonocytogenesCICC216352金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusCICC216003大腸桿菌O157:H7EscherichiacoliCICC215304蠟樣芽孢桿菌BacilluscereusCMCC633015腸炎沙門氏菌SalmonellaenteritidisCICC214826鼠傷寒沙門氏菌SalmonellatyphimuriumCICC214837福氏志賀菌ShigellaflexneriCMCC515718副溶血性弧菌VibrioparahemolyticusCICC215289創(chuàng)傷弧菌VibriovulnificusATCC275626.2細(xì)菌DNA提取試劑盒VazymeDC103細(xì)菌DNA提取試劑盒6.3聚合酶螺旋反應(yīng)試劑（-20℃保存）Isothermalbuffer（10×）：200mMTris-HCl，500mM氯化鉀，100mM硫酸銨，20mM硫酸鎂和1%Tween20；硫酸鎂（100mM）；dNTP（10mM）；甜菜堿（5M）；BstDNA聚合酶；Evegreen；羥基萘酚藍(lán)指示劑（3mM）。7檢測(cè)程序食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌的PSR快速檢測(cè)程序，見圖1。圖1食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌的PSR快速檢測(cè)程序圖8操作步驟8.1樣品制備、增菌培養(yǎng)8.1.1方法一純菌液檢測(cè)將標(biāo)準(zhǔn)菌株富集為菌懸液并直接提取核酸，核酸濃度為20ng/μL-100ng/μL。8.1.2方法二樣品中致病菌的檢測(cè)無菌操作取25g（mL）待測(cè)樣品，并將其置于盛有225mL的共增菌培養(yǎng)基中，在37℃，180rpm條件下培養(yǎng)8h-18h。8.2核酸提取8.2.1利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，將上述菌液中的DNA進(jìn)行提取。具體操作步驟參考試劑盒說明書進(jìn)行。8.2.2提取前應(yīng)使用20mg/mL溶菌酶對(duì)菌液進(jìn)行破壁處理。提取后的DNA使用超微量分光光度計(jì)測(cè)量模板濃度與純度。8.3恒溫?cái)U(kuò)增8.3.1恒溫?cái)U(kuò)增體系見表2下述恒溫?cái)U(kuò)增體系組分儲(chǔ)存于-20℃，使用前置于冰浴中溶解混勻。（主要引物Ft、Bt與加速引物IF、IB可提前以2：1的比例混合使用。）表2恒溫?cái)U(kuò)增體系添加順序組分及工作濃度終濃度1Isothermalbuffer（10×）1×2甜菜堿（5M）0.5-1.4M3dNTP（10mM）0.5-1.6mM4MgSO4（100mM）2.0-8.0mM5Ft/Bt（50μM）各0.64μM6IF/IB（50μM）各0.32μM7DNA20-100ng/μL8H2O補(bǔ)齊至25μL9EveGreen（20×）/HNB1μL8.3.2擴(kuò)增程序65℃金屬浴反應(yīng)60min，再在85℃下反應(yīng)2min（使酶滅活），即可完成擴(kuò)增反應(yīng)。先置于65℃反應(yīng)60min，再轉(zhuǎn)入85℃，孵育2min。8.4菌株檢測(cè)8.4.1實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)熒光信號(hào)。（1）自反應(yīng)開始每隔60s收集一次熒光信號(hào)，該階段循環(huán)30-60次，即反應(yīng)30-60min（循環(huán)階段）；（2）循環(huán)階段結(jié)束后，升溫至85℃，反應(yīng)2min（使酶滅活階段）通過擴(kuò)增曲線情況選擇優(yōu)化條件。任意一個(gè)反應(yīng)孔有S型擴(kuò)增曲線則判定為陽性，即該樣本中還有對(duì)應(yīng)檢測(cè)項(xiàng)目的核酸；沒有擴(kuò)增曲線則判定為陰性，即該樣本不含有對(duì)應(yīng)檢測(cè)項(xiàng)目的核酸。8.4.2瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。對(duì)應(yīng)泳道產(chǎn)生階梯狀條帶則為陽性，即該樣本中還有對(duì)應(yīng)檢測(cè)項(xiàng)目的核酸；泳道內(nèi)無條帶產(chǎn)生則為陰性，即該樣本不含有對(duì)應(yīng)檢測(cè)項(xiàng)目的核酸。8.4.3羥基萘酚藍(lán)顏色指示劑在反應(yīng)體系中加入1μL羥基萘酚藍(lán)顏色指示劑，3min中內(nèi)反應(yīng)管內(nèi)反應(yīng)液為藍(lán)色則為陽性；反應(yīng)管內(nèi)反應(yīng)液為紫色則為陰性。8.5實(shí)驗(yàn)對(duì)照檢測(cè)過程中分別設(shè)空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照?？瞻讓?duì)照以滅菌水替代DNA模板；陰性對(duì)照為非目標(biāo)菌DNA提取物或試劑盒內(nèi)的陰性對(duì)照；陽性對(duì)照為目標(biāo)菌DNA模板。9質(zhì)量控制以下條件有一條不滿足時(shí)，實(shí)驗(yàn)視為無效：空白對(duì)照：反應(yīng)時(shí)間45min內(nèi)，實(shí)時(shí)熒光法無熒光信號(hào)檢出；凝膠電泳法無階梯狀條；指示劑法反應(yīng)液呈紫色。陰性對(duì)照：反應(yīng)時(shí)間45min內(nèi)，實(shí)時(shí)熒光法無熒光信號(hào)檢出；凝膠電泳法無階梯狀條；指示劑法反應(yīng)液呈紫色。c)陽性對(duì)照：反應(yīng)時(shí)間45min內(nèi)，實(shí)時(shí)熒光法出現(xiàn)熒光擴(kuò)增曲線；凝膠電泳法出現(xiàn)階梯狀條；指示劑法反應(yīng)液呈藍(lán)色。10結(jié)果表述10.1結(jié)果為陰性，表述為“未檢出XXX核酸”。10.2結(jié)果為陽性，表述為“XXX初篩陽性”，陽性樣本按GB4789.10和GB4789.30進(jìn)行確證并報(bào)告結(jié)果。11生物安全措施11.1實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、設(shè)施要求及廢棄物處理應(yīng)符合GB19489的規(guī)定。11.2聚合酶螺旋擴(kuò)增技術(shù)的核酸擴(kuò)增與檢測(cè)工作應(yīng)由具備生物實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn)人員承擔(dān)。11.3檢驗(yàn)過程中防止交叉污染的措施應(yīng)按照GB/T27403的規(guī)定執(zhí)行。

附錄A（規(guī)范性附錄）聚合酶螺旋擴(kuò)增反應(yīng)試劑組分和存放條件A.1細(xì)菌DNA提取試劑盒與聚合酶螺旋擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒組分及存放條件表A.1細(xì)菌DNA提取試劑盒組分及存放條件序號(hào)名稱存放條件備注1細(xì)菌DNA提取試劑盒常溫2溶菌酶-20℃3RNase-20℃4蛋白酶K-20℃表A.2聚合酶螺旋擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒成分及存放條件序號(hào)名稱存放條件備注1熒光恒溫?cái)U(kuò)增預(yù)混液-20℃Isothermalbuffer、甜菜堿、dNTP、MgSO4等2陽性對(duì)照-20℃致病菌對(duì)應(yīng)的模板DNA3陰性對(duì)照-20℃滅菌去離子水4顏色指示劑4℃羥基萘酚藍(lán)A.2聚合酶螺旋擴(kuò)增所使用的引物固定體系與引物序列表A.3聚合酶螺旋擴(kuò)增所使用的引物混合固定體系組分體積（引物濃度為50μM）Ft主要引物0.25μLBt主要引物0.25μLIF加速引物0.125μLIB加速引物0.125μL表A.4聚合酶螺旋擴(kuò)增反應(yīng)所使用的引物序列物種目標(biāo)基因引物名稱序列5’-3’金黃色葡萄球菌nucFtCCTCTTTGCGTATTGCCCTTGCTGGCATATGTATGGCAATCBtTTCCCGTTATGCGTTTCTCCTACGCCATTATCTGTTTGTGAIFCGAAACATTACTGATAGCCATCCCIBGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGC單增李斯特菌hlyAFtTTTTACAGGGAGAACATCTATTTCGAGCCTAACCTATCCBtTCTACAAGAGGGACATTTTTACCGTTTGATTTAGTGGCATTIFGCTTTTACGAGAGCACCIBGCCAGGTATGACTAATCAAGAC

附錄B（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基及試劑B.1共增菌培養(yǎng)基適用于金黃色葡萄球菌與單增李斯特菌B.1.1成分胰蛋白胨17.0g/L蛋白胨5.0g/L酵母粉6.0g/L磷酸二氫鉀1.4g/L磷酸氫二鉀9.0g/L大豆蛋白胨16g/L氯化鈉20g/L葡萄糖15.5g/L丙酮酸鈉12g/L亞碲酸鉀2.5mg/L萘啶酮酸2mg/LB.1.2制法將胰蛋白胨、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、大豆蛋白胨、氯化鈉加入990mL蒸餾水中，加熱溶解后冷卻至室溫，并用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4，隨后121℃滅菌20min。葡萄糖與丙酮酸鈉配置成濃度為300g/L的母液；亞碲酸鉀配置成濃度為1g/L的母液；萘啶酮酸加入0.1M的N