GB∕T 36789-2018 動物狂犬病病毒核酸檢測方法

GB/T36789—2018國家市場監(jiān)督管理總局中國國家標準化管理委員會1Ⅱ1210×Taq緩沖液(含Mg2+)、2.5mmol/LdNTPs、50μmol/L寡聚脫氧胸苷酸引物[Oligo(dT)1?Prim-er]、50μmol/L隨機引物、25mmol/L氯化鎂(MgCl?)、10%聚乙二醇3.2.5引物及探針序列，見附錄C。4.1.1對可疑為狂犬病而撲殺或死亡的動物，應在死亡后盡早無菌采集腦組織，放入滅菌容器內；對待活檢動物，采集腦脊液和唾液拭子，生物安全要求見附錄D。4.1.2將待檢樣品置于2C<8℃的運輸霜內運輸；如不能立即運輸，可置于樣品保存管內，-20℃以下保存，保存期間避免反復凍融，樣品置于一70℃以下可長期保存。4.1.3新鮮冷藏或冰凍樣品均應盡快運送至檢測地點。4.2樣品處理4.2.1腦組織脊髓和唾液腺稱取0.1g待檢動物腦組組、脊髓或唾液腺樣品，置于離心管中。加入400μLKPBS充分研磨。腦組織研磨液經℃3000rmin離心20min取100L上清放到15m離心管中，待檢。4.2.2唾液拭子樣品將唾液拭子棉簽倒置于離心管中，4℃3000r/min寓心10min取上清200μL,置1.5mL離心管4.2.3腦脊液或細胞培養(yǎng)物樣品取腦脊液棒品或細胞培養(yǎng)物200L,置1.5ml離心管中，待檢4.3核酸提取4.3.1提取樣品總RNA,可果用本標準推薦方法，或選擇商業(yè)試劑盒，按照試劑盒說明進行。4.3.2取100μL腦組織、4.3.3每個樣品管中加200μL三氯甲烷，振蕩20s,4℃12000r/min離心10min。4.3.4轉移4.3.3中的600pL上清液至新離心管，加等體積的異丙醇，混勻后4℃靜置10min,4℃4.3.5棄上清液，沉淀中加1mL75%乙醇，4℃12000r/min離心10min,棄上清，留沉淀，將離心管倒置于吸水紙上干燥。4.3.6將離心管中RNA沉淀用10pμLDEPC水充分溶解。4.4.1對照設立設置要求：從樣品處置開始應設置陽性對照、陰性對照。陽性對照：取已知陽性的同類樣品作為陽性對照。也可以將適量滅活的狂犬病病毒添加到已知陰3性樣品中作為陽性對照。陰性對照：取已知陰性的同類樣品作為陰性對照。采用4.3的方法提取陽性對照和陽性對照的RNA。反應體系：以Oligo(dT)?sOligo(dT)1sPrimer(10×反轉錄緩沖液反轉錄酶RNA酶抑制劑反應條件：42℃孵育1.5h后，95℃反應5min,產物為cDNA。4.4.3外套PCR反應體系雙蒸水10×Taq緩沖液(含Mg2+)外套上游引物外套下游引物dNTPs1.0μL4.4.2的反應產物cDNA保存于4℃產物為外套PCR反應產物。反應體系：取2μL外套PCR產物作為內套PCR的模板進行套式PCR,每個樣品建立50μL內套內套上游引物內套下游引物外套反應產物反應條件：94℃,2min后；94℃30s→56℃30s→72℃40s進行為外套PCR反應產物，保存于4℃。配制適量的電泳及制膠用的緩沖液和1%瓊脂糖凝膠(見附錄B)。將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后在適當位置處插上梳子。凝膠厚度一般在3mm～5mm之間。取PCR產物與上樣緩沖液混勻，44.4.6實驗成立的條件被檢樣品的外套PCR產物出現845bp擴增條帶，內套PCR產物出現371bp特異性條帶，或僅內陽性對照：取已知限性的同類樣品作為陽性對照。也可以將適量滅活的狂犬病病毒添加到已知陰性樣品中作為用性對照。陰性對眼：取日知陰性的同類樣品作為陰性對照4.5.2熒光定量RT-PCR反應體系建立每個樣品建立50L熒光定量RT-PCR體系，組成如下DEPC水RNA酶抑制劑度轉錄酶下游引物工作液L0.5pL2江4.5.3熒光定量RT-PCR擴增42℃30min;92℃3min;92℃30s→55℃30s→72℃20s進行45個循環(huán)；設置72℃時收集熒4.5.4結果分析條件設定直接讀取檢測結果。閾值設定原則根據儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品5陰性對照無Ct值，且無典型擴增曲線。陽性對照Ct值<26,且出現典型擴增曲線。實驗結果6狂犬病是由狂犬病毒屬(Lyssavirusgenus)成員引起的一種具有高度嗜神經性的烈性傳染病。分別為狂犬病病毒(Rabiesvirus,RA7B.1.1成分磷酸二氫鈉磷酸氫二鈉(Na?HPO,·12H:O)B.2TAE電泳緩沖液的制備B.2.1.1成分二水乙二胺四乙酸二鈉g將二水乙二胺四乙酸二的加入到89mL滅菌雙蒸水中，用氫氧化鈉(約2g)調pH至8.0,二水乙B.3TAE電泳緩沖液(50倍)配制B.3.1成分羥基甲基氨基甲烷(Tris)0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液(p將羥基甲基氨基甲烷(Tris)加入57.1mL冰乙酸和0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液(pH8.0)100mL,加滅菌雙蒸水至1000mL。8TAE電泳緩沖液(50倍)9引物名稱引物序列(5’-3’)外套上游引物5’-ATGTAACNCCTCTACAATGG-3’外套下游引物5’-GCCCTGGTTCGAACATTCT-3’內套上游引物5’-ACAATGGAKKCTGACAARATTG-3’內套下游引物5'-CCTGYYWGAGCCCAGTTVCCY