GB∕T 36789-2018 動(dòng)物狂犬病病毒核酸檢測方法

GB/T36789—2018國家市場監(jiān)督管理總局中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)1Ⅱ1210×Taq緩沖液(含Mg2+)、2.5mmol/LdNTPs、50μmol/L寡聚脫氧胸苷酸引物[Oligo(dT)1?Prim-er]、50μmol/L隨機(jī)引物、25mmol/L氯化鎂(MgCl?)、10%聚乙二醇3.2.5引物及探針序列，見附錄C。4.1.1對(duì)可疑為狂犬病而撲殺或死亡的動(dòng)物，應(yīng)在死亡后盡早無菌采集腦組織，放入滅菌容器內(nèi)；對(duì)待活檢動(dòng)物，采集腦脊液和唾液拭子，生物安全要求見附錄D。4.1.2將待檢樣品置于2C<8℃的運(yùn)輸霜內(nèi)運(yùn)輸；如不能立即運(yùn)輸，可置于樣品保存管內(nèi)，-20℃以下保存，保存期間避免反復(fù)凍融，樣品置于一70℃以下可長期保存。4.1.3新鮮冷藏或冰凍樣品均應(yīng)盡快運(yùn)送至檢測地點(diǎn)。4.2樣品處理4.2.1腦組織脊髓和唾液腺稱取0.1g待檢動(dòng)物腦組組、脊髓或唾液腺樣品，置于離心管中。加入400μLKPBS充分研磨。腦組織研磨液經(jīng)℃3000rmin離心20min取100L上清放到15m離心管中，待檢。4.2.2唾液拭子樣品將唾液拭子棉簽倒置于離心管中，4℃3000r/min寓心10min取上清200μL,置1.5mL離心管4.2.3腦脊液或細(xì)胞培養(yǎng)物樣品取腦脊液棒品或細(xì)胞培養(yǎng)物200L,置1.5ml離心管中，待檢4.3核酸提取4.3.1提取樣品總RNA,可果用本標(biāo)準(zhǔn)推薦方法，或選擇商業(yè)試劑盒，按照試劑盒說明進(jìn)行。4.3.2取100μL腦組織、4.3.3每個(gè)樣品管中加200μL三氯甲烷，振蕩20s,4℃12000r/min離心10min。4.3.4轉(zhuǎn)移4.3.3中的600pL上清液至新離心管，加等體積的異丙醇，混勻后4℃靜置10min,4℃4.3.5棄上清液，沉淀中加1mL75%乙醇，4℃12000r/min離心10min,棄上清，留沉淀，將離心管倒置于吸水紙上干燥。4.3.6將離心管中RNA沉淀用10pμLDEPC水充分溶解。4.4.1對(duì)照設(shè)立設(shè)置要求：從樣品處置開始應(yīng)設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照。陽性對(duì)照：取已知陽性的同類樣品作為陽性對(duì)照。也可以將適量滅活的狂犬病病毒添加到已知陰3性樣品中作為陽性對(duì)照。陰性對(duì)照：取已知陰性的同類樣品作為陰性對(duì)照。采用4.3的方法提取陽性對(duì)照和陽性對(duì)照的RNA。反應(yīng)體系：以O(shè)ligo(dT)?sOligo(dT)1sPrimer(10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液反轉(zhuǎn)錄酶RNA酶抑制劑反應(yīng)條件：42℃孵育1.5h后，95℃反應(yīng)5min,產(chǎn)物為cDNA。4.4.3外套PCR反應(yīng)體系雙蒸水10×Taq緩沖液(含Mg2+)外套上游引物外套下游引物dNTPs1.0μL4.4.2的反應(yīng)產(chǎn)物cDNA保存于4℃產(chǎn)物為外套PCR反應(yīng)產(chǎn)物。反應(yīng)體系：取2μL外套PCR產(chǎn)物作為內(nèi)套PCR的模板進(jìn)行套式PCR,每個(gè)樣品建立50μL內(nèi)套內(nèi)套上游引物內(nèi)套下游引物外套反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)條件：94℃,2min后；94℃30s→56℃30s→72℃40s進(jìn)行為外套PCR反應(yīng)產(chǎn)物，保存于4℃。配制適量的電泳及制膠用的緩沖液和1%瓊脂糖凝膠(見附錄B)。將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后在適當(dāng)位置處插上梳子。凝膠厚度一般在3mm～5mm之間。取PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液混勻，44.4.6實(shí)驗(yàn)成立的條件被檢樣品的外套PCR產(chǎn)物出現(xiàn)845bp擴(kuò)增條帶，內(nèi)套PCR產(chǎn)物出現(xiàn)371bp特異性條帶，或僅內(nèi)陽性對(duì)照：取已知限性的同類樣品作為陽性對(duì)照。也可以將適量滅活的狂犬病病毒添加到已知陰性樣品中作為用性對(duì)照。陰性對(duì)眼：取日知陰性的同類樣品作為陰性對(duì)照4.5.2熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系建立每個(gè)樣品建立50L熒光定量RT-PCR體系，組成如下DEPC水RNA酶抑制劑度轉(zhuǎn)錄酶下游引物工作液L0.5pL2江4.5.3熒光定量RT-PCR擴(kuò)增42℃30min;92℃3min;92℃30s→55℃30s→72℃20s進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；設(shè)置72℃時(shí)收集熒4.5.4結(jié)果分析條件設(shè)定直接讀取檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品5陰性對(duì)照無Ct值，且無典型擴(kuò)增曲線。陽性對(duì)照Ct值<26,且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果6狂犬病是由狂犬病毒屬(Lyssavirusgenus)成員引起的一種具有高度嗜神經(jīng)性的烈性傳染病。分別為狂犬病病毒(Rabiesvirus,RA7B.1.1成分磷酸二氫鈉磷酸氫二鈉(Na?HPO,·12H:O)B.2TAE電泳緩沖液的制備B.2.1.1成分二水乙二胺四乙酸二鈉g將二水乙二胺四乙酸二的加入到89mL滅菌雙蒸水中，用氫氧化鈉(約2g)調(diào)pH至8.0,二水乙B.3TAE電泳緩沖液(50倍)配制B.3.1成分羥基甲基氨基甲烷(Tris)0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液(p將羥基甲基氨基甲烷(Tris)加入57.1mL冰乙酸和0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液(pH8.0)100mL,加滅菌雙蒸水至1000mL。8TAE電泳緩沖液(50倍)9引物名稱引物序列(5’-3’)外套上游引物5’-ATGTAACNCCTCTACAATGG-3’外套下游引物5’-GCCCTGGTTCGAACATTCT-3’內(nèi)套上游引物5’-ACAATGGAKKCTGACAARATTG-3’內(nèi)套下游引物5'-CCTGYYWGAGCCCAGTTVCCY