1.2-基因工程的基本操作程序

1.2基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四個步驟1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建3、目的基因?qū)胧荏w細胞4、目的基因的檢測與鑒定有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用

載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。

才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。一、目的基因的獲取1目的基因主要是編碼蛋白質(zhì)的基因：如：與生物抗性相關(guān)的基因、與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因、與生物藥物和保健品相關(guān)的基因、與毒物降解相關(guān)的基因、與工業(yè)用酶相關(guān)的基因、具調(diào)控作用的因子等。2獲取目的基因的常用方法：1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)擴增3、人工合成1.從基因文庫中獲取目的基因1.基因文庫的概念:將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因。2.基因文庫的種類:基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫某生物體內(nèi)全部DNA

許多DNA片段受體菌群體限制酶與運載體連接導(dǎo)入基因組文庫cDNA反轉(zhuǎn)錄受體菌群體與運載體連接導(dǎo)入cDNA文庫某種生物某個時期的mRNA基因的結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點外顯子內(nèi)含子終止子啟動子原核真核原核細胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子①不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)②調(diào)控遺傳信息表達,上游的RNA聚合酶結(jié)合位點:基因結(jié)構(gòu)真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)內(nèi)含子外顯子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有RNA聚合酶結(jié)合位點(啟動子)。與RNA聚合酶結(jié)合位點基因結(jié)構(gòu)原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_____的，邊_________邊_________編碼區(qū)是間隔的、_____的，先_____后_____相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼轉(zhuǎn)錄翻譯轉(zhuǎn)錄翻譯基因文庫的構(gòu)建方法①基因組文庫的構(gòu)建提取某種生物的全部DNA用適當?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接重組載體基因組文庫導(dǎo)入受體菌中儲存②cDNA文庫的構(gòu)建-----逆轉(zhuǎn)錄法：提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時期的mRNA單鏈DNA雙鏈cDNA片段重組載體與載體連接cDNA文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶導(dǎo)入受體菌中儲存思考？真核生物的基因用逆轉(zhuǎn)錄法得到的cDNA與原基因相同嗎？真核細胞的cDNA的獲取編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)DNA聚合酶剪接有關(guān)的酶RNA聚合酶mRNA前體mRNA單鏈DNAcDNA逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄剪接逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制啟動子終止子基因不含非編碼序列。即不含非編碼區(qū)和內(nèi)含子基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較

文庫類型cDNA文庫

基因組文庫

文庫大小基因中啟動子（具有啟動作用的DNA片段）基因中內(nèi)含子(位于編碼蛋白質(zhì)序列的非編碼DNA片段）

基因多少

物種間的基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢?依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性④從基因文庫中得到目的基因的方法2.利用PCR技術(shù)擴增目的基因1概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)。2原理：DNA復(fù)制原料：模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶多聚酶鏈式反應(yīng)體外特定DNA片段3前提：已知目的基因的一段核苷酸序列PCR技術(shù)的操作過程aDNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成________b、退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d.重復(fù)a.b.c步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加___倍一2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因PCR技術(shù)的操作過程PCR反應(yīng)體系中目的基因成指數(shù)(2n)形式擴增PCR技術(shù)擴增與DNA復(fù)制的比較DNA復(fù)制PCR技術(shù)場所原理條件解旋方式酶特點結(jié)果堿基互補配對原則堿基互補配對原則四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制半保留復(fù)制、全解旋再復(fù)制體外復(fù)制主要在細胞核內(nèi)大量的DNA片段形成整個DNA分子熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細胞內(nèi)的DNA聚合酶、解旋酶等PCR技術(shù)的操作過程aDNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成________b、退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d.重復(fù)a.b.c步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加___倍一人工合成法反轉(zhuǎn)錄法目的基因的信使RNA目的基因化學(xué)合成法肽鏈氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成推測推測單鏈DNA合成

在基因較小，核苷酸序列已知的情況下，可以利用DNA合成儀人工合成蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化學(xué)合成推測推測思考：化學(xué)法合成的目的基因含內(nèi)含子、啟動子和終止子嗎？目的基因的獲取1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)擴增3、人工合成種類基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫二、基因表達載體的構(gòu)建——基因工程的核心1目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。2基因表達載體的組成：復(fù)制原點+目的基因+啟動子+終止子+標記基因表達載體啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來基因表達載體的構(gòu)建過程質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個切口兩個黏性末端注意：①載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復(fù)制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵③啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少④目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。三、將目的基因?qū)胧荏w細胞1轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。2常用的受體細胞：大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。3目的基因?qū)胧荏w細胞的原理：借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。1、目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。②原理：Ti質(zhì)粒上的T---DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。三、目的基因?qū)胧荏w細胞構(gòu)建基因表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌植物細胞導(dǎo)入穩(wěn)定維持和表達③過程：1、目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ?）基因槍法：目的基因?qū)雴巫尤~植物細胞①操作方法：利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。②

鎢粉粒子和金粉粒子，粒子的直徑一般在0.6～4um。③適用：通常是單子葉植物1、目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ?）花粉管通道法：將目的基因?qū)胫参锛毎俨僮鞣椒ǎ涸谥参锘ㄊ芊酆螅ǚ坌纬苫ǚ酃苓€末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞②

特點:十分簡便經(jīng)濟。③例：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉2、將目的基因?qū)雱游锛毎俜椒ǎ猴@微注射法①程序目的基因表達載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動物3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎傥⑸镒魇荏w細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少②常用菌：大腸桿菌③常用法：Ca2+處理獲得感受態(tài)細胞④過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)

細胞感受態(tài)細胞吸收DNA表達載體與感受態(tài)細胞混合小結(jié)：將目的基因?qū)胧荏w細胞生物種類植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射技術(shù)Ca2+處理法受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉(zhuǎn)化過程將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細胞→整合到受體細胞的DNA→表達將含有目的基因的表達載體提純→取卵（受精卵）→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2+處理細胞→感受態(tài)細胞→重組表達載體與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收DNA分子四、目的基因的檢測與鑒定導(dǎo)入過程完成后，全部受體細胞都能攝入重組DNA分子嗎？1真正能攝入重組DNA分子的受體細胞很少。2目的基因進入受體細胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達？不一定，需要檢測1、鑒定——分子水平的鑒定轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針15N15N14N14N（1）檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因基因探針：放射性同位素等標記的DNA分子方法——DNA分子雜交技術(shù)變性變性1、鑒定——分子水平的鑒定變性方法——分子雜交技術(shù)（2）檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA14N14N1、鑒定——分子水平的鑒定提取（3）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)2、鑒定——個體水平的鑒定抗蟲、抗病接種實驗，活性比較實驗例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。思考？不能，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達。受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達嗎？課堂練習(xí)1、有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是()A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來

B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得

C、目的基因須由運載體導(dǎo)入受體細胞

D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶A課堂練習(xí)2、下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成②從基因組文庫中提?、蹚氖荏w細胞中提?、芾肞CR技術(shù)⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄 ⑥人工合成

A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥D(zhuǎn)課堂練習(xí)3、有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）

A、限制酶只在獲得目的基因時才用

B、重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成

C、質(zhì)粒都可作為運載體

D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料D【拓展深化】

工具酶只有兩種：限制酶在操作程序1、2中用到且要求用同一種，目的是產(chǎn)生相同的黏性末端；DNA連接酶只在操作程序2中用到。課堂練習(xí)4、基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是

（）

A、人工合成目的基因

B、目的基因與運載體結(jié)合

C、將目的基因?qū)胧荏w細胞

D、目的基因的檢測和表達C【拓展深化】只有第三步將目的基因?qū)胧荏w細胞不需堿基互補配對，其余三個步驟都涉及堿基互補配對課堂練習(xí)即時應(yīng)用(隨學(xué)隨練，輕松奪冠)5．(2009年高考浙江卷)下列關(guān)于基因工程的敘述，錯誤的是(

)A．目的基因和受體細胞均可來自動、植物或微生物B．限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶是兩類常用的工具酶C．人胰島素原基因在大腸桿菌中表達的胰島素原無生物活性D．載體上的抗性基因有利于篩選含重組DNA的細胞和促進目的基因的表達D基因工程高考專題

1、下列是同種限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的粘性末端的是（）A．①②B．②③C．③④D．②④E。⑤⑥E2.(2008)已知某種限制性內(nèi)切酶在一線性DNA分子上有3個酶切位點，如圖中箭頭所指，如果該線性DNA分子在3個酶切位點上都被該酶切斷，則會產(chǎn)生a、b、c、d四種不同長度的DNA片段?，F(xiàn)有多個上述線性DNA分子，若在每個DNA分子上至少有一個酶切位點被該酶切斷，則理論上講，經(jīng)該酶酶切后，這些線性DNA分子最多能產(chǎn)生長度不同的DNA片段種類數(shù)是A.3B.4C.9D.12C4、下面圖中a、b、c、d代表的結(jié)構(gòu)正確的是（）A．a(chǎn)--質(zhì)粒RNAB．b--限制性外切酶C．c--RNA聚合酶D．d—外源基因

D

5、我國科學(xué)工作者經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)一種生活在棉鈴蟲消化道內(nèi)的蘇云金芽孢桿菌能分泌一種毒蛋白使棉鈴蟲致死，而此毒蛋白對人畜無害。通過科技攻關(guān)，我國科工作者已成功地將該毒蛋白基因?qū)嗣藁ㄖ仓牦w內(nèi)并實現(xiàn)了表達。由于棉鈴蟲吃了新品種“轉(zhuǎn)基因抗蟲棉”植株后就會死亡，所以該棉花新品種在近年推廣后，已收到了很好的經(jīng)濟效益，請據(jù)以上所給材料回答下列問題：(1)害蟲抗藥性的增強是

的結(jié)果(2）“轉(zhuǎn)基因”抗蟲棉新品種的培育應(yīng)用了新技術(shù)(3)在培育新基因抗蟲棉新品種過程中，所用的基因的“剪刀”是

，基因的“針線”是

，基因的“運載工具”是

(5)“轉(zhuǎn)基因抗蟲棉”抗害蟲的遺傳信息傳遞過程可以表示為

(6)該科技成果在環(huán)保上的重要作用是

自然選擇基因工程(或DNA重組技術(shù))限制酶DNA連接酶；運載體抗蟲基因mRNA毒蛋白減少農(nóng)藥對環(huán)境的污染，保護了生態(tài)環(huán)境7、（2005·廣東生物·22）以下有關(guān)基因工程的敘述，正確的是（）

A、基因工程是細胞水平上的生物工程

B、基因工程的產(chǎn)物對人類部是有益的

C、基因工程產(chǎn)生的變異屬于人工誘變

D、基因工程育種的優(yōu)點之一是目的性強D6、鐮刀型細胞貧血癥的病因是血紅蛋白基因的堿基序列發(fā)生了改變。檢測這種堿基序列改變必須使用的酶是（）

A、解旋酶B、DNA連接酶

C、限制性內(nèi)切酶D、RNA聚合酶C8、（2005·江蘇生物·11）能夠使植物體表達動物蛋白的育種方法是（）

A、單倍體育種

B、雜交育種

C、基因工程育種

D、多倍體育種C9。(高考試題：2007廣東生物)7.現(xiàn)有一長度為1000堿基對(by）的DNA分子，用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR1酶切后得到的DNA分子仍是1000by，用Kpn1單獨酶切得到400by和600by兩種長度的DNA分子，用EcoRI,Kpnl同時酶切后得到200by和600by兩種長度的DNA分子。該DNA分子的酶切圖譜正確的是【答案】D10、采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)人目的基因的作法正確的是（）①將毒素蛋白注射到棉受精卵中②將編碼毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中③將編碼毒素蛋白的DNA序列，與質(zhì)粒重組，導(dǎo)人細菌，用該細菌感染棉的體細胞，再進行組織培養(yǎng)④將編碼毒素蛋白的DNA序列，與質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進入受精卵A．①②B．②③C．③④D．④①C11、番茄在運輸和貯藏過程中，由于過早成熟而易腐爛，應(yīng)用基因工程技術(shù)，通過抑制某種促進果實成熟激素的合成能力，可使番茄貯藏時間延長，培育成耐貯藏的番茄新品種，這種轉(zhuǎn)基因番茄已于1953年在美國上市，請回答：(1)在培育轉(zhuǎn)基因番茄的基因操作中，所用的基因的“剪刀”是

，基因的“針線”是

,基因的“運輸工具”是

(2)與雜交育種、誘變育種相比，通過基因工程來培育新品種的主要優(yōu)點是

限制酶DNA連接酶運載體目的性強，育種周期短；克服遠緣雜交不親和的障礙1