3第一章-蛋白質

第一節(jié)氨基酸第二節(jié)肽第三節(jié)蛋白質的結構第四節(jié)蛋白質結構與功能的關系第五節(jié)蛋白質的理化性質第六節(jié)蛋白質的分離純化第一章蛋白質構件小分子→聚合物→結構→功能→性質第五節(jié)蛋白質的理化性質一、蛋白質的兩性性質和等電點二、蛋白質的紫外吸收性質三、蛋白質的膠體性質四、蛋白質的沉淀反應五、蛋白質的變性與復性六、蛋白質的呈色反應一、蛋白質的兩性性質和等電點1.蛋白質的兩性性質在生理條件下，蛋白質表現(xiàn)酸性或堿性，是兩性電解質。pH=pI

凈電荷=0

pH<pI凈電荷為正pH>pI凈電荷為負PrCOOHNH3++H++

OH-+H++

OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+蛋白質的等電點的大小和它所含的酸性AA及堿性AA的數量比例有關：2.蛋白質的等電點

蛋白質溶液的pH在等電點時溶解度最小。

蛋白質在遠紫外光區(qū)（200-230nm）有較大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用這一特性對蛋白質進行定性定量鑒定。蛋白質質量濃度/（mg/ml）=1.55A1cm-0.76A1cm280260測定范圍：0.1～0.5mg/ml二、蛋白質的紫外吸收性質如：－NH3＋、－COO－、－OH、-SH、-CONH-等，它們都具有高度的親水性，當與水接確時，極易吸附水分子，使蛋白質顆粒外圍形成一層水化膜，將顆粒彼此隔開，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。三、蛋白質膠體性質

由于蛋白質分子量很大，在水溶液中形成直徑1-100nm之間的顆粒，已達到膠體顆粒范圍的大小，因而具有膠體溶液的通性。

蛋白質的水溶液能形成穩(wěn)定的親水膠體的原因：

１、蛋白質多肽鏈上含有許多極性基團。

2、蛋白質是兩性電解質，在非等電狀態(tài)時，相同蛋白質顆粒帶有同性電荷，使蛋白質顆粒之間相互排斥，保持一定距離，不致互相凝聚而沉淀。蛋白質溶液由于具有水化層與電荷兩方面的穩(wěn)定因素，所以作為膠體系統(tǒng)是相對穩(wěn)定的。蛋白質膠體性質的應用

由于膠體溶液中的蛋白質不能通過半透膜，因此可以應用透析法將非蛋白的小分子雜質除去。透析法：以半透膜提純蛋白質的方法叫透析法半透膜：只允許溶劑小分子通過，而溶質大分子不能通過，如羊皮紙、火棉膠、玻璃紙等四.蛋白質的沉淀反應定義：蛋白質在溶液中靠水膜和電荷保持其穩(wěn)定性，水膜和電荷一旦除去，蛋白質溶液的穩(wěn)定性就被破壞，蛋白質就會從溶液中沉淀下來，此現(xiàn)象即為蛋白質的沉淀作用。酸酸堿堿堿酸溶液中蛋白質的聚沉（一）可逆沉淀定義：在溫和條件下，通過改變溶液的pH或電荷狀況，使蛋白質從膠體溶液中沉淀分離。在沉淀過程中，結構和性質都沒有發(fā)生變化，在適當的條件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀?？赡娉恋硎欠蛛x和純化蛋白質的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。1.

鹽析

在蛋白質的水溶液中，加入大量高濃度的強電解質鹽如硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等，可破壞蛋質分子表面的水化層，中和它們的電荷，因而使蛋白質沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析。

而低濃度的鹽溶液加入蛋白質溶液中，會導致蛋白質的溶解度增加，該現(xiàn)象稱為鹽溶。鹽析的機理：

破壞蛋白質的水化膜，中和表面的凈電荷。鹽析法是最常用的蛋白質沉淀方法

各種蛋白質的親水性及荷電性均有差別，因此不同蛋白質所需中性鹽濃度也有不同，只要調節(jié)中性鹽濃度，就可使混合蛋白質溶液中的幾種蛋白質分散沉淀析出，這種方法稱為分段鹽析。

我國很早便創(chuàng)造了將大豆蛋白質的濃溶液加熱并點入少量鹽鹵（含MgCl2）的制豆腐方法，這是成功地應用加熱變性沉淀蛋白的一個例子。老豆腐：鹽鹵作凝固劑（含水量80%—85%）嫩豆腐：石膏或葡萄糖酸內酯作凝固劑制（含水量為85%—90%）實例分析2.等電點沉淀

用弱酸或弱堿調節(jié)蛋白質溶液的pH處于等電點處，使蛋白質沉淀。弱酸或弱堿沉淀法機理：

破壞蛋白質表面凈電荷。3.

有機溶劑沉淀法：

在蛋白質溶液中，加入能與水互溶的有機溶劑如乙醇、丙酮等，蛋白質產生沉淀。有機溶劑沉淀法的機理：

破壞蛋白質的水化膜。注意：有機溶液沉淀蛋白質通常在低溫條件下進行，否則有機溶劑與水互溶產生的溶解熱會使蛋白質產生變性。（二）不可逆沉淀定義：在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質的結構和性質，產生的蛋白質沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質的結構和性質的變化，所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀（次級鍵）、強酸堿沉淀（影響電荷）、重金屬鹽沉淀（Hg2+、Pb2+

、Cu2+、Ag2+）和生物堿試劑或某些酸類沉淀等都屬于不可逆沉淀。4.重金屬鹽沉淀(條件：pH稍大于pI為宜)

當pH稍大于pI時，蛋白質顆粒帶負電荷這樣就容易與重金屬離子結合成不溶性鹽而沉淀。重金屬沉淀法的機理：重金屬鹽加入之后，與帶負電的羧基結合。

5.生物堿試劑沉淀法（條件：pH稍小于pI）

生物堿是植物組織中具有顯著生理作用的一類含氮的堿性物質。能夠沉淀生物堿的試劑稱為生物堿試劑。生物堿試劑一般為弱酸性物質，如單寧酸、苦味酸等。

生物堿試劑沉淀蛋白質的機理：

在酸性條件下，蛋白質帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結合而產生沉淀。實例分析

在啤酒生產工藝中有麥芽汁加啤酒花煮沸的工序，其目的之一就是借酒花中的單寧類物質懷變性蛋白質或鹽形成沉淀，使麥芽汁得以澄清，從而防止成品啤酒產生蛋白質混濁。“柿石癥”的產生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的單寧酸，使腸胃中的蛋白質凝固變性而成為不能被消化的“柿石”6.加熱變性沉淀法

加熱使蛋白質天然構象解體，疏水基外露，水化層被破壞，從而發(fā)生沉淀。

如：煮雞蛋鹽析法：脫去水化層，中和電荷有機溶劑沉淀法：脫去水化層等電點沉淀法：破壞電荷

重金屬鹽沉淀法：破壞電荷生物堿試劑沉淀法：破壞電荷加熱變性沉淀法：破壞水化層蛋白質沉淀法小結不可逆沉淀可逆沉淀天然蛋白質因受物理、化學因素的影響，使蛋白質分子的構象發(fā)生了異常變化，從而導致生物活性的喪失以及物理、化學性質的異常變化。變性的實質是次級鍵被破壞，天然構象解體。變性不涉及共價鍵的破裂，一級結構保持完好。五、蛋白質的變性與復性1、變性的概念2、引起蛋白質變性的主要因素：A.物理因素：加熱、高壓、紫外線照射、X-射線、超聲波、劇烈振蕩和攪拌等B.化學因素：強酸、強堿、脲、去污劑（十二烷基硫酸鈉（SDS））、重金屬鹽、三氯乙酸、濃乙醇等。蛋白質變性后的特征：（1）生物活性喪失；（2）溶解度降低，粘度增加，易絮凝；（3）一些側鏈基團暴露，易發(fā)生化學反應；（4）變性后蛋白質分子結構松散，易被水解酶作用；（5）組分和分子量沒變（一級結構沒變）。3、蛋白質變性后的特征蛋白質變性的應用豆腐是大豆蛋白質的濃溶液加熱加鹽而成的變性蛋白凝固體。急救重金屬鹽中毒時，可給患者吃大量乳品或蛋清。4.蛋白質的復性定義：當變性因素除去后，變性蛋白質又可恢復到天然構象，這一現(xiàn)象稱為蛋白質的復性。天然構象尿素，

-巰基乙醇變性狀態(tài)去除變性劑并緩慢氧化

反應試劑顏色反應基團★雙縮脲反應

NaOH,稀CuSO4

紫紅2個或2個以上肽鍵★Folin酚試劑反應CuSO4磷鎢酸-鉬酸蘭色酚基★茚三酮反應茚三酮蘭紫色游離氨基

Millon反應Millon試劑紅色酚基黃色反應HNO3及NH3黃、橘黃苯環(huán)乙醛酸反應乙醛酸，H2SO4

紫紅色氨酸吲哚基坂口反應次氯酸鈉,萘酚,NaOH紅色精氨酸的胍基

六、蛋白質的呈色反應★蛋白質定量、定性測定常用方法雙縮脲反應含有兩個以上肽鍵的多肽，具有與雙縮脲相似的結構特點，也能發(fā)生雙縮脲反應，生成紫紅色或藍紫色絡合物。紅紫色絡合物(鹼性溶液)Cu2+雙縮脲是兩分子的尿素經加熱失去一分子NH3而得到的產物肽和蛋白質所特有而氨基酸所沒有的顏色反應第一節(jié)氨基酸第二節(jié)肽第三節(jié)蛋白質的結構第四節(jié)蛋白質結構與功能的關系第五節(jié)蛋白質的理化性質第六節(jié)蛋白質的分離純化第一章蛋白質構件小分子→聚合物→結構→功能→性質第六節(jié)蛋白質的分離純化一、蛋白質分離純化的一般原則二、分離純化蛋白質的一般程序三、蛋白質含量測定與純度鑒定四、蛋白質相對分子量的測定一、蛋白質分離純化的一般原則防止變性和降解低溫、條件溫和二.蛋白質分離純化的一般程序1.前處理生物組織破碎、溶解、離心分離

蛋白質提取液2.粗分級鹽析、等電點沉淀、超濾、有機溶劑分級分離3.細分級層析、電泳精制品

4.結晶結晶或凍干粉適宜介質2、根據溶解度等電點沉淀鹽析（常用硫酸銨）有機溶劑沉淀3、根據電離性質電泳離子交換層析1、根據分子大小透析或超濾離心沉淀凝膠過濾層析4、特異親和力：親和層析蛋白質分離純化的方法

透析和超濾密度梯度離心凝膠過濾層析原理大分子先下來小分子后下來電泳法蛋白質顆粒的大小、形狀、所帶的電荷不同，在電場中的泳動速度不同離子交換層析親合層析親和蛋白配基

蛋白質純度的鑒定方法：采用物理化學方法如電泳、離心沉降、HPLC和溶解度分析等。采用任何單獨的一種方法鑒定純度只能作為蛋白質均一性的必要條件而非充分條件，必須同時采用2-3種不同的方法才能確定。三、蛋白質含量測定與純度鑒定

測定蛋白質含量的常用方法：凱氏定氮法雙縮脲法（540nm）

Folin-酚試劑法（500nm）紫外吸收法（280nm）染料（考馬斯亮藍）結合法（595nm）比色法靈敏度低靈敏度高2、根據溶解度等電點沉淀鹽析（常用硫酸銨）有機溶劑沉淀3、根據電離性質電泳離子交換層析1、根據分子大小透析或超濾離心沉淀凝膠過濾層析4、特異親和力：親和層析蛋白質分離純化的方法四、蛋白質相對分子量的測定

超速離心：蛋白質溶液經高速離心分離時，由于比重關系，蛋白質分子趨于下沉，沉降速度與蛋白質顆粒大小成正比，應用光學方法觀察旋離過程中蛋白質顆粒的沉降行為凝膠過濾法：測定蛋白質的相對分子量SDS：測定蛋白質的相對分子量毛細管電泳質譜分析

SDSseparatesproteinsbyMWSDS（十二烷基硫酸鈉）一種陰離子去污劑，作為變性劑破壞分子內的疏水作用和氫鍵。目前測定亞基分子量的最好辦法。不同的SDS-蛋白質復合體具有相同的荷質比和相同的構象，因此遷移率不受原有的電荷、分子形狀的影響，只取決于分子量。且SDS以其烴鏈與蛋白質分子的