儀器分析-高效液相色譜法

第三章高效液相色譜法HighPerformanceLiquidChromatography

(HPLC)一、高效液相色譜法的特點1.高效液相色譜法概述2.高效液相色譜與氣相色譜的比較

GCHPLC應用范圍熱穩(wěn)定、低沸點的物質熱不穩(wěn)定、高沸點、離子型的物質熱力學理論較成熟正在發(fā)展中分析成本低高分離能力與柱的類型有關較高3.高效液相色譜法與經典液相色譜法的比較

經典液相色譜法高效液相色譜法粒徑(μm)75-6003-50（常用5-10）柱前壓力(atm)0.01-1.020-300分析時間(h)1-200.05-1.0色譜柱長度(cm)50-2002-30柱效(塊/m)2-50104-105樣品用量(g)1-1010-6-10-24.高效液相色譜法的特點高壓高速高效高靈敏度5.應用舉例人參Ginseng人參、西洋參與三七的鑒別R1Rg1ReRb1RdABCRg1Rg1ReReRfRb1RcRb2RdRc三種藥材的HPLC指紋圖譜二、高效液相色譜理論基礎H=A+B/u+CuA=2λdpB→0C=?高效液相色譜中的速率方程

遷移的流動相的傳質阻力滯留的流動相的傳質阻力高效液相色譜中的速率方程渦流擴散項縱向擴散流動相傳質滯留區(qū)傳質固定相內傳質2.對速率方程的討論選用細顆粒填料可獲高柱效流動相流速低，有利于達到高柱效選用黏度小的流動相有利于提高柱效溫度的影響液膜厚度的影響3.柱外效應由于色譜柱之外的因素引起的色譜峰的展寬，例如進樣系統(tǒng)、連接管路及檢測器的死體積等。三、高效液相色譜儀1.高效液相色譜儀流程高效液相色譜儀2.高壓輸液系統(tǒng)

往復泵原理示意圖往復泵梯度洗提梯度洗提

即程序控制流動相的組成，使在整個分離過程中，溶劑強度按照特定的變化規(guī)律增加。

優(yōu)點：分離復雜混合物，使所有組分都處在最佳的k值范圍內。

缺點：檢測器的使用受到限制，分析結果的重復性取決于流速的穩(wěn)定性。柱子需進行再生處理。溶劑A溶劑B電磁閥A電磁閥B混合室泵溶劑A溶劑B高壓泵A

高壓泵B混合室低壓溶劑梯度方框圖高壓溶劑梯度方框圖梯度洗提流程應用舉例3.進樣系統(tǒng)

六通進樣閥結構示意圖4.分離系統(tǒng)——色譜柱

包括柱管與固定相兩部分一般色譜柱長5～30cm，內徑為4～5mm凝膠色譜柱內徑3～12mm微柱內徑1-2mm，長1-5cm制備往內徑較大，可達25mm以上5．檢測系統(tǒng)

紫外檢測器示差折光檢測器熒光檢測器電導檢測器（1）紫外檢測器固定波長的紫外檢測器可變波長的紫外檢測器二極管陣列檢測器固定波長的紫外檢測器Z型流通池結構可變波長的紫外檢測器二極管陣列檢測器二極管陣列檢測器之三維圖二極管陣列檢測器之IsoabsorbancePlot

響應特性選擇性檢測器，如芳烴類化合物的檢測靈敏度高，可檢測10-9g/mL的物質線性范圍寬，104-105對溫度及流動相的改變不敏感適合梯度洗提HPLC常規(guī)檢測器應用舉例波長的選擇（2）示差折光檢測器結構響應特性通用性檢測器低靈敏度基線易受溫度的影響不適合梯度洗提熒光檢測器結構響應特性選擇性檢測器。如PAH，蛋白質高靈敏度，比紫外高約1000倍適合梯度洗提應用舉例電導檢測器結構響應特性選擇性檢測器，對離子型化合物有響應靈敏度高受溫度的影響不能梯度洗提（5）幾種檢測器特性比較

示差折光紫外熒光電導應用范圍通用選擇性高選擇性選擇性可否梯度淋洗不可可可不可線性范圍104105103104最小檢測量μgngpgng對溫度敏感度敏感低低敏感溶劑使用情況無限制受限制受限制受限制四、HPLC主要類型及其選擇

化學鍵合相色譜法液固色譜法離子對色譜法離子色譜法體積排阻色譜法1.化學鍵合相色譜法（1）分離機理正相鍵合相色譜法：固定相的極性大于流動相的極性，適用于分離油溶性或水溶性的極性或強極性化合物。

分配機理：分配系數(shù)

x為溶質，M為溶劑

反相鍵合相色譜法：固定相的極性小于流動相的極性，適于分離非極性、極性和離子性化合物。應用最廣泛反相鍵合相色譜法的疏溶劑機理：溶質進入極性流動相后，排擠部分溶質分子，其疏水基團由于流動相的斥力推動而直接與非極性固定相上的烷基締合，構成單分子吸附層，這種作用時可逆的。當流動相極性減小時，這種疏溶劑斥力下降。（2）固定相

疏水基團如不同鏈長的烷烴（C8和C18）和苯基等極性基團如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。類型分離方式應用特點C-18反相、離子對普適性好，保留值大。溶于水的高極性化合物、中等極性化合物C-8反相、離子對與C-18類似，保留值略小C-3,C-4反相保留值小，適合肽類和蛋白質苯基反相保留適中，選擇性不同。非極性、中等極性化合物-CN反相、正相選擇性與硅膠類似，保留小，用途廣-NH2反相、正相分離糖類、核苷酸、固醇等二醇基正相分離有機酸、排阻分蛋白質等醚基反相、正相分離酚類、芳硝基化合物，保留比C-18強聚苯乙烯基反相pH使用范圍廣，對部分分離峰形好，壽命長常用固定相應用舉例（3）流動相表征溶劑特性的重要參數(shù)溶劑強度ε°：溶劑分子與吸附劑的親合程度，ε°越大，親合力約大。溶解度參數(shù)δ：衡量溶劑極性強度的指標，δ越大，極性越強。是溶劑和溶質分子間色散力、偶極力、接受質子或給予質子能力的總和。所以δ相近的混合溶劑，它的選擇性α不同。極性參數(shù)P’：溶劑與乙醇、二氧六環(huán)、硝基甲烷相互作用的度量，比較全面的反映了溶劑的性質。粘度η：溶劑Eηε°δPˊxexdxn正己烷1.880.300.017.30.1

四氫呋喃7.60.460.579.14.00.380.200.42乙腈37.50.340.6511.85.80.310.270.42甲醇32.70.540.9512.95.10.480.220.31水78.50.89

2110.20.370.370.25溶劑的選擇原則溶劑具有穩(wěn)定的化學性質溶劑的選擇與使用的檢測器要有相容性溶劑的粘度要小溶劑的沸點不能太低溶劑的純度要高且價格便宜

溶劑選擇分組正相：正己烷、正庚烷、乙醚、二氯甲烷、氯仿等，己烷為主體，加入質子接受體乙醚或甲基叔丁基醚，質子給予體氯仿，偶極溶劑二氯甲烷

反相：水、甲醇、乙腈、四氫呋喃、乙醇及其混合物等，以水為主體，加入質子接受體甲醇，質子給予體乙腈，偶劑溶劑四氫呋喃。應用舉例2.液固色譜法（1）分離機理以固體吸附劑為固定相的液相色譜法。由于溶質分子和流動相分子在吸附劑表面的吸附活性中心上進行競爭吸附，這種競爭吸附形成不同溶質在吸附劑表面的吸附、解吸平衡。平衡常數(shù)的不同導致不同溶質得以分離。

（2）固定相

極性固定相：硅膠、氧化鎂、氧化鋁等非極性固定相：活性炭、高分子多孔微球、碳多孔微球等

（3）流動相ε°越大，洗脫力越強。合適的洗脫強度可通過混合溶劑來得到硅膠為固定相時：以弱極性的正構烷烴為主體，加入二氯甲烷等中等極性溶劑調節(jié)合適的洗脫強度?？捎盟畬枘z進行減活處理，或加入四氫呋喃、乙腈、甲醇、異丙醇等改性劑舉例（4）應用中等分子量的油溶性樣品如油品、脂肪、芳烴等不同極性取代基的化合物結構異構體和幾何異構體混合物的分離應用舉例3.離子對色譜法（1）分離機理將一種或數(shù)種與樣品離子電荷（A+）相反的離子(B-)（稱為對離子或反離子）加入到色譜系統(tǒng)流動相中，使其與樣品離子結合生成弱極性的離子對（中性締合物）的分離方法。多為反相離子對色譜

（2）固定相、流動相和離子對試劑固定相：多為C18,C8反相鍵合相流動相：以水為主的緩沖液，或水-甲醇、水-乙腈等混合溶劑離子對試劑：四丁基銨正離子、十六烷基三甲基銨正離子，ClO4-，十二烷基磺酸根等

（3）應用有機酸、有機堿特別是強酸強堿的分析，如羧酸、磺酸、胺類、酚類、藥物、染料等4.離子色譜法

(1)分離機理試樣中的離子與離子交換樹脂上的離子發(fā)生反應：

陽離子交換：樹脂—SO3-H++M+=樹脂—SO3-M++H+

陰離子交換：樹脂—NR3+Cl-+X-=樹脂—NR3+X-+Cl

-不同的離子與樹脂離子的交換能力（親和能力）不同，親和力越大，離子越難洗脫，從而得以分離。離子交換色譜與離子色譜的分離原理一樣離子色譜最大的改進是解決了微量組分的檢測問題

雙柱抑制型：在分離柱和檢測器之間加一個化學抑制器，其作用有二，一是降低淋洗液的背景電導，二是增加被測離子的電導值，改善信噪比。靈敏度高。

單柱非抑制型：淋洗液直接進入電導檢測器。簡單、分辨率較好。（2）固定相離子交換劑，最常用的是乳膠薄殼型離子交換樹脂小球，根據功能基可分為：強酸型（磺酸基團）、強堿型（季銨基）、弱酸型（羧酸）、弱堿型（伯、仲、叔胺）（3）流動相

雙柱抑制型：分離陽離子，一般采用無機酸如HCl，HNO3等；分離陰離子，一般采用NaOH、NaHCO3/NaCO3。

單柱非抑制型：分離陽離子，用低濃度的HCl，HNO3等；分離陰離子，可用苯甲酸及其鹽、酒石酸、檸檬酸等

（4）應用分析無機陰離子的首選方法還可用于分析無機陽離子，有機酸、堿，糖類、蛋白質等。應用舉例5.體積排阻色譜法（SEC）

(1)分離原理以多孔凝膠為固定相，利用精確控制的凝膠孔徑，使樣品中不同分子大小的組分得以分離。

VR=V0+KD·Vp0<KD<1.0洗脫體積在V0

和V0+Vp之間，峰容量有限，10-12個峰用于分離分子大小差大于10%的樣品分離原理示意圖使用水溶液的凝膠過濾色譜法（GFC），主要用于分析多肽、蛋白質、核酸、多糖等。使用有機溶劑的凝膠滲透色譜法(GPC)，主要用于高聚物（如聚乙烯、聚氯乙烯等）分子量的測定（2）固定相軟質凝膠：如交聯(lián)葡聚糖等，水相分離生化體系，適于低、中壓操作半剛性凝膠：較高交聯(lián)度的苯乙烯、二乙烯苯共聚物，有機相洗脫，可承受10Mpa的壓力硬質凝膠高交聯(lián)度苯乙烯、二乙烯苯共聚物：凝膠滲透色譜法多孔球形硅膠：凝膠過濾色譜法、凝膠滲透色譜法羥基化聚醚多孔微球：凝膠過濾色譜法

（3）流動相改善分離主要通過固定相來實現(xiàn)。流動相的選擇原則是：溶解樣品、與凝膠浸潤、與檢測器匹配、粘度小。如四氫呋喃；緩沖溶液（4）應用大分子的分離分析聚合物分子量分布的測定應用舉例1.聚乙二醇400002.聚乙二醇100003.聚乙二醇30004.聚乙二醇10005.聚乙二醇6.液相色譜分離類型及條件選擇選擇合適的液相色譜分離類型

了解分析對象要分析的組分的大致濃度干擾物質試樣的性質結構分子量酸堿性溶解性溶于水——排阻色譜，水為流動相相對分子質量＞2000不溶于水——排阻色譜，非水流動相同系物——鍵合相色譜不溶于水異構體——液固色譜樣品分子大小差異——排阻色譜反相鍵合相色譜相對分子質量溶于水，不離解＜2000排阻色譜，水為流動相