Ecad在膀胱癌中的表達(dá)及意義

1/1Ecad在膀胱癌中的表達(dá)及意義E-cad在膀胱癌中的表達(dá)及意義作者：

張東東1,梁衍鋒1,羅振國2作者單位：

1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007;2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154003【摘要】目的：

探討E-cad在膀胱癌中的表達(dá)及意義。

方法：

通過免疫組織化學(xué)法和RT-PCR法檢測E-cad在膀胱癌和正常膀胱組織中的表達(dá)。

結(jié)果：

免疫組織化學(xué)方法對正常膀胱組織和膀胱癌組織中的E-cad進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)E-cad蛋白在膀胱癌組織中的陽性表達(dá)率為32.39%(23/71)，正常膀胱黏膜組織表達(dá)的陽性率為100%，E-cad在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯低于正常組織。

RT-PCR法從基因水平檢測正常膀胱組織和膀胱癌組織中E-cad的表達(dá)，E-cad在正常膀胱組織所得光密度值為0.9400.052，膀胱癌組織的光密度值為0.7540.044，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，E-cad在膀胱癌組織中的表達(dá)與正常膀胱組織表達(dá)相比差異有顯著性(t=11.142，P0.01)。

結(jié)論：

無論是在蛋白還是基因水平上，E-cad在膀胱癌組織中的表達(dá)低于正常膀胱組織的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】E-cad;膀胱癌;組織;免疫組化;RT-PCRAbstract:Objective：

ToinvestigatetheexpressionandsignificanceofE-cadherininurinarybladdercancer.Methods：

TheE-cadherinexpressionwasdetectedbyimmunohistochemistryandRT-PCRinthenormalurinarybladdertissueandurinarybladdercancertissue.Results：

Immunechistochemistry(SABC)methodshowedthepositiverateoftheE-cadherinexpressionwas32.39%(23/71)inurinarybladdercancerand100%inthenormalurinarybladdertissue.TheE-cadherexpressioninurinarybladdercancertissuewassignificantlylowerthanthatinthenormalurinarybladdertissue.RT-PCRmethodshowedtheopticaldensityvalueofE-cadherinwas0.9400.052inthenormalurinarybladdertissueandthatwas0.7540.044intheurinarybladdercancertissue.TheE-cadherinexpressionintheurinarybladdercancertissuewassignificantlylowerthanthatinthenormalurinarybladdertissue(P0.01).Conclusion：

Atbothproteinandgenelevels，theE-cadherinexpressionlevelislowerintheurinarybladdercancertissuethanthatinthenormalurinarybladdertissue.Keywords:E-cadherin;urinarybladdercancer;tissue;immunohistochemistry;RT-PCR膀胱癌是泌尿系統(tǒng)腫瘤中最常見的一種原發(fā)于膀胱上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，是一類惡性程度較高的疾病。

膀胱癌的發(fā)病因素包含很多，其中主要是與患者的基因和環(huán)境因素有關(guān)。

在以往研究中發(fā)現(xiàn)，膀胱癌的發(fā)生是由膀胱細(xì)胞內(nèi)單個或多個基因的改變決定的，主要是癌基因的激活和抗癌基因的失活，因此，對膀胱的分子遺傳學(xué)研究不僅有助于腫瘤的診斷及預(yù)后判斷，而且對腫瘤發(fā)病機(jī)制及腫瘤基因的研究均有著十分重要的意義。

現(xiàn)在膀胱腫瘤的標(biāo)記物有許多，我們主要研究的是E-鈣黏素(E-cadherin，E-cad)，E-cad基因定位于16q22.1，cDNA全長48kb，開放閱讀框架長2652bp，編碼含884個氨基酸的多肽[1];基因組DNA長達(dá)100kb，含16個外顯子，15個內(nèi)含子。

E-cad在體內(nèi)有兩種存在形式，組織型和可溶型[2]。

研究發(fā)現(xiàn)E-cad是維持組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，使細(xì)胞能正常有序的進(jìn)行增殖、分化，從而避免細(xì)胞失控性生長，而抑制腫瘤的形成。

但是在腫瘤細(xì)胞中，特別是惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)E-cad的功能會出現(xiàn)不穩(wěn)定，主要表現(xiàn)是表達(dá)下降、缺失，或者是E-cad與細(xì)胞骨架連接的破裂，異常定位[3]。

以往的研究主要是通過免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行研究，本次實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)和RT-PCR法檢測E-cad在正常膀胱組織和膀胱癌組織中的表達(dá)，通過分析正常膀胱組織和膀胱癌組織中E-cad的蛋白水平上的表達(dá)和基因水平上的表達(dá)相互關(guān)系，為膀胱癌的發(fā)生、診斷以及治療提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料新鮮的正常膀胱組織10例，膀胱移行細(xì)胞癌組織31例，標(biāo)本來自佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院和佳木斯市中心醫(yī)院。

1.2實(shí)驗(yàn)主要試劑瓊脂糖(美國Sigma公司)，Trizol(美國Invitrogen公司)，引物、GAPDH、DEPC、RNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)有限公司)、TaqDNA聚合酶、2000bpMarker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)，兔抗人E-cad多克隆抗體、枸櫞酸緩沖液、PBS緩沖液、DAB顯色試劑盒、SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法RT-PCR法提取RNA及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所使用的所有器具均在使用前經(jīng)濃酸浸泡過夜，流水沖凈后，0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水浸泡過夜，高溫高壓滅菌后烤干密封保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR操作所用耗材只需高溫高壓蒸氣滅菌。

1.3.1提取總RNA并檢測其質(zhì)量勻漿處理組織，離心后取澄清的勻漿液加入氯仿，劇烈振蕩。

再次離心取上層水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中加入無水乙醇，混勻后離心棄掉流出液。

重復(fù)上一步一次。

再次離心去除殘余液體。

加入無RNase的水后離心，放置保存。

溶解好的RNA溶液，加DEPC水稀釋，微量比值，確定RNA純度和濃度，糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.3.2反轉(zhuǎn)錄依據(jù)試劑反應(yīng)體系對提取的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA-20℃保存。

將反轉(zhuǎn)錄的cDNA擴(kuò)增。

1.3.3RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線制備，瓊脂糖凝膠電泳。

利用天能GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)對RT-PCR實(shí)驗(yàn)所得凝膠進(jìn)行分析，得出數(shù)據(jù)。

1.3.4免疫組化(SABC)法取正常膀胱組織和膀胱癌組織的免疫組化標(biāo)本按以下步驟進(jìn)行：

室溫下，10%甲醛溶液浸泡標(biāo)本24h。

脫水，石蠟包埋，切片。

常規(guī)石蠟切片脫蠟至水。

甲醇-H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物，梯度乙醇水化后用PBS沖洗。

微波修復(fù)后加血清覆蓋組織(5%BSA)，水浴箱加熱。

加一抗，4℃冰箱過夜。

PBS沖洗，加滴二抗，水浴箱加熱，PBS沖洗后加SABC，再次水浴箱加熱并沖洗。

加DAB顯色劑，靜止，上色，入水阻斷，蘇木素復(fù)染。

入水，入鹽酸酒精，入水酚化，去蘭。

梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片，光鏡下觀察，計(jì)數(shù)、拍照。

1.4結(jié)果評定染色結(jié)果判定：

E-cad陽性細(xì)胞為細(xì)胞膜或細(xì)胞漿著棕黃色，細(xì)胞膜染色呈顆?；蚓€狀，細(xì)胞漿染色呈斑片狀。

E-cad表達(dá)分3級：

陰性(-)，細(xì)胞無棕色染色且陽性細(xì)胞數(shù)10%;陽性(+)，細(xì)胞淺棕黃色染色且陽性細(xì)胞數(shù)為10%～50%;強(qiáng)陽性(++)，細(xì)胞棕黃色染色且陽性細(xì)胞數(shù)50%。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0ForWindows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果2.1RT-PCR法E-cad的檢測E-cad在膀胱癌組織中光密度值明顯低于正常膀胱組織的光密度值見表1，E-cad在膀胱癌組織的表達(dá)明顯低于正常膀胱組織的表達(dá)。

RT-PCR法檢測E-cad在正常膀胱組織和膀胱癌組織的光密度值變化2.2免疫組化E-cad的檢測正常膀胱黏膜組織為陽性表達(dá)，膀胱發(fā)生癌性病變時(shí)表達(dá)低或不表達(dá)。

通過免疫組化法發(fā)現(xiàn)E-cad在膀胱癌組織中的陽性表達(dá)率為32.39%(23/71)，正常膀胱黏膜組織表達(dá)的陽性率為100%，E-cad在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯低于正常組織。

免疫組化法分析E-cad在正常膀胱組織和膀胱癌組織的表達(dá)3討論近年來研究發(fā)現(xiàn)E-cad在膀胱中具有黏附性，在正常膀胱黏膜中的E-cad均會出現(xiàn)陽性表達(dá)，膀胱癌E-cad出現(xiàn)低表達(dá)或不表達(dá)[4，5]。

本實(shí)驗(yàn)使用免疫組織化學(xué)方法對正常膀胱組織和膀胱癌組織中的E-cad進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)E-cad蛋白在膀胱癌組織中的陽性表達(dá)率為32.39%(23/71)，正常膀胱黏膜組織表達(dá)的陽性率為100%，E-cad在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯低于正常組織。

本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR法從基因水平檢測正常膀胱組織和膀胱癌組織中E-cad的表達(dá)，E-cad在正常膀胱組織所得光密度值高于膀胱癌組織的光密度值，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，E-cad在膀胱癌組織中的表達(dá)與正常膀胱組織表達(dá)相比差異有顯著性。

無論是在蛋白水平還是基因水平上，E-cad在膀胱癌組織中的表達(dá)都低于正常膀胱組織的表達(dá)。

這提示E-cad抑制在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。

通過本次實(shí)驗(yàn)研究能為膀胱癌的發(fā)生、診斷和治療等提供一定的基礎(chǔ)理論依據(jù)。

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