DNMT3B基因啟動(dòng)子C46359T多態(tài)性及食管癌易感性關(guān)聯(lián)分析

1/1DNMT3B基因啟動(dòng)子C46359T多態(tài)性及食管癌易感性關(guān)聯(lián)分析1DNMT3B基因啟動(dòng)子C46359T多態(tài)性及食管癌易感性關(guān)聯(lián)分析DNMT3B基因啟動(dòng)子C46359T多態(tài)性及食管癌易感性關(guān)聯(lián)分析【摘要】目的：

探討DNMT3B基因啟動(dòng)子C46359T單核苷酸多態(tài)性與江蘇漢族人群食管癌易感性的關(guān)系。

方法：

提取195例食管癌患者及１89例健康體檢人員外周血基因組DNA，采用PCPPPPPP結(jié)合DNA測序技術(shù)檢測DNMT3B基因啟動(dòng)子C46359T單核苷酸多態(tài)性。

結(jié)果：

正常對(duì)照DNMT3BC46359T等位基因TT/CT基因型頻率為98.9%/1.1%,病例組為97.9%/2.1%，在對(duì)照組與病例組中均未檢測到DNMT3B46359CC基因型。

攜帶DNMT3B46359CT等位基因的個(gè)體與對(duì)照組相比，其患食管癌的易感性未見明顯升高(Ｐ=0.43,OP=1.96，95%CI：

0.35～10.82)。

對(duì)比江蘇漢族人群和英國、美國白種人群，DNMT3BC46359T單核苷酸多態(tài)性頻率分布有明顯差異(Ｐl(wèi)t;0.01)。

結(jié)論：

DNMT3B基因C46359T多態(tài)性可能不適合作為中國漢族人群食管癌易感性的一個(gè)獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，此位點(diǎn)多態(tài)性的分布在不同人種間有顯著差異。

【關(guān)鍵詞】DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B食管癌單核苷酸多態(tài)2性畢業(yè)論文腫瘤的病因?qū)W，尤其是其與某些遺傳性疾患關(guān)系的研究已表明,大多數(shù)人類惡性腫瘤是由環(huán)境因素作用于遺傳物質(zhì)的結(jié)果［1］，遺傳因素越來越被認(rèn)為是癌癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的主要因素之一［2P3］。

盡管有些基因突變可以導(dǎo)致腫瘤，但是對(duì)于大多數(shù)人來說，患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)可能來自于相對(duì)常見的低外顯率的疾病相關(guān)多態(tài)性的差異［3］。

腫瘤不僅是遺傳性疾病，同時(shí)也是由基因轉(zhuǎn)錄沉默所引起的表觀遺傳性疾病。

在一些人類腫瘤細(xì)胞中，啟動(dòng)子區(qū)CpG島的重新甲基化可能是腫瘤抑制基因失活的機(jī)制［4］。

DNA甲基化的異常是最常見的表觀遺傳學(xué)改變，DNA甲基化是由一組DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferase，DNMT)家族催化的，目前在哺乳動(dòng)物中確定的DNMT有DNMT1、DNMT3A和DNMT3B［5P7］。

其中，DNMT1主要負(fù)責(zé)維持甲基化，而DNMT3A和DNMT3B主要負(fù)責(zé)重新甲基化［6，8］。

DNMT3B在腫瘤形成過程中起重要作用，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中存在DNMT3B的高表達(dá)［5］。

DNMT3B基因定位于20號(hào)染色體q11.2，在距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-149堿基對(duì)的啟動(dòng)子區(qū)含有CT轉(zhuǎn)換多態(tài)性（C46359T），體外實(shí)驗(yàn)表明，該位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換可以使DNMT3B啟動(dòng)子的活性增加30%［9］。

3食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在發(fā)展中國家居第5位，我國的食管癌死亡率居世界首位［10］。

早期食管癌經(jīng)手術(shù)切除后5年生存率可達(dá)90％以上，而中晚期患者僅為6％～15％［11P12］。

如果能夠做到早期診斷或易感風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，則有可能降低食管癌的死亡率。

本研究選擇江蘇地區(qū)漢族人群，探討DNMT3B基因C46359T位點(diǎn)基因多態(tài)性與該地區(qū)人群食管癌遺傳易感性之間的關(guān)聯(lián)。

論文代寫1材料和方法1.1材料畢業(yè)論文病例組選自2007年2月～2007年7月在江蘇省腫瘤醫(yī)院、南京軍區(qū)南京總醫(yī)院保存的食管癌病人血液樣本195例，其中男153例，女42例，所有病例臨床資料完整。

血液標(biāo)本采集前均未有抗腫瘤藥物使用記錄。

對(duì)照組為健康人血液樣本189例，其中性別、年齡等均與病例組相匹配，男135例，女54例,見表1。

兩組人群均系江蘇地區(qū)漢族人群，個(gè)體之間均無血緣關(guān)系。

1.2方法1.2.1基因組DNA抽提采集靜脈全血2ml，乙二胺四乙酸二鉀((DTAP(2)抗凝，常規(guī)蛋白酶(消化后苯酚／氯仿抽提，乙醇沉淀法提取基因組DNA［6］，總共提取食管癌患4者、健康正常人外周血DNA384例，提取的DNA溶解于pH8.0T(中，4℃保存。

表1病例組與對(duì)照組樣本間年齡和性別分布頻率比較例注：

括弧中為所占百分比1.2.2PCPPCP引物序列見文獻(xiàn)［13］，上游55PTGCTGTGACAGGCAGAGCAGP35(nt4615146170)，下游55PGGTAGCCGGGAACTCCACGGP35(nt4653046511)，擴(kuò)增產(chǎn)物380bp。

25l反應(yīng)體系含dNTPs0.1mmolP-1，上下游引物各10pmol，TaqDNA聚合酶1．25U，DNA1.0l(100ng)，MgC122.0mmolP-1。

95℃預(yù)變性5min；95℃30s，69℃30s，共32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。

PCP產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色觀察。

畢業(yè)論文1.2.3限制性內(nèi)切酶BlnⅠ酶切反應(yīng)20l酶切反應(yīng)體系含10(Buffer2.0l，BlnⅠ(Ta(aPa公司)4U，PCP產(chǎn)物2.0l，混勻后37℃水浴中酶切過夜。

酶切產(chǎn)物于2.0％瓊脂糖凝膠電泳分析基因型。

1.2.4DNA序列測定選擇凝膠電泳證實(shí)為CT基因型、TT基因型各2例，由南京金思特公司經(jīng)雙脫氧鏈終止法測序。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，計(jì)算Ｐ值、OP值和95%CI。

論文代寫52結(jié)果論文代寫2.1一般資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)畢業(yè)論文經(jīng)雙側(cè)卡方檢驗(yàn)，在病例與對(duì)照組中，年齡在40～60歲和gt;60歲的分別為60.0%/39.5%和49.2%/50.3%，男、女分別為78.5%/21.5%和71.4%/28.6%，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Ｐg(shù)t;0.05），見表1。

論文代寫2.2DNMT3B啟動(dòng)子C46359TPCP產(chǎn)物分析畢業(yè)論文PCP產(chǎn)物為380bp的片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定,結(jié)果見圖1。

經(jīng)限制性內(nèi)切酶BlnⅠ酶切后，當(dāng)nt46359處為T時(shí)，BlnⅠ可將PCP產(chǎn)物切為207bp和173bp兩個(gè)片段；當(dāng)nt46359處為C時(shí)，BlnⅠ不能將PCP產(chǎn)物切開，只有1個(gè)380bp的片段；當(dāng)nt46359處為CT時(shí)，為380bp、207bp和173bp3個(gè)片段，見圖2。

為證實(shí)酶切結(jié)果，將凝膠電泳證實(shí)為CT基因型、TT基因型各2例PCP產(chǎn)物送至測序公司（南京金思特公司）進(jìn)行測序，其中箭頭所示為DNMT3B啟動(dòng)子C46359T多態(tài)性位點(diǎn)，見圖3。

論文代寫2.3DNMT3BC46359T等位基因頻率在病例組和對(duì)照組中的分布經(jīng)HardyPH(inberg遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)，病例和對(duì)照組的基因型分布符合遺傳平衡定律。

結(jié)果顯示，正常對(duì)照中DNMT3BC46359T等位基因TT/CT基因型頻率為698.9%/1.1%,T的頻率為99.47%，C的頻率為0.53%；病例組中TT/CT基因型頻率為97.9%/2.1%,T頻率為98.97%，C的頻率為1.03%。

經(jīng)2檢驗(yàn)，DNMT3BC46359T等位基因TT/CT基因型頻率在正常人群和食管癌患者中分布差異沒有顯著性(P=0.43)，對(duì)照組與病例組中均未檢測到DNMT3B46359CC基因型。

見表2。

注：

括弧中為所占百分比2.4DNMT3BC46359T等位基因頻率在中國漢族人和英國、美國白種人中的分布經(jīng)與文獻(xiàn)報(bào)道的DNMT3BC46359T等位基因頻率分別在英國和美國白種人［9，14］之間比較，顯示英國、美國白種人中TT、CT和CC基因型分別占23.2%/45.0%/31.8%和23.2%/41.8%/35%，而中國漢族人TT和CT基因型分別為98.9%和1.1%，中國漢族人DNMT3BC46359T等位基因頻率分布與英、美兩國白種人存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Ｐl(wèi)t;0.01），見表3。

3討論單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異引起的DNA序列多態(tài)性，在人群中的頻率大于1％,是人類可遺傳變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90％以上［15］。

SNP與腫瘤等許多疾病的易感性有關(guān)［16］。

研究表明，位7于基因啟動(dòng)子區(qū)的SNP能影響基因的表達(dá)或酶的活性［13P14］。

DNA甲基化在胚胎發(fā)育和印跡基因的轉(zhuǎn)錄抑制，如X染色體的失活以及許多人類腫瘤中重要基因的異常沉默中起重要作用［17］。

DNMT3B基因啟動(dòng)子區(qū)-149位C46359T多態(tài)性與乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌以及急性白血病等多種腫瘤易感性有關(guān)［9，14，18P20］。

這些研究提示該位點(diǎn)的遺傳變異可能與多種腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，該位點(diǎn)可能作為評(píng)價(jià)人群腫瘤易感性的一個(gè)指標(biāo)。

到目前為止，C46359T是否與食管癌易感性有關(guān)尚不清楚。

表3DNMT3B基因啟動(dòng)子區(qū)C46359T等位基因頻率注：

括弧中為所占百分比食管癌是我國常見的一種消化道腫瘤，因其缺乏有效的早期診斷指標(biāo)，當(dāng)患者出現(xiàn)癥狀時(shí)往往為中晚期，不利于治療，且預(yù)后不良。

為了給食管癌提供一個(gè)早期診斷指標(biāo)，我們對(duì)DNMT3B基因啟動(dòng)子區(qū)上游149位C46359T多態(tài)性與食管癌的易感性進(jìn)行了研究。

本研究所得DNMT3B基因啟動(dòng)子區(qū)-149位點(diǎn)基因型分布結(jié)果符合HardyPH(Inberg平衡定律。

正常對(duì)照組中TT基因型為98.9%，CT基因型為1.1%，病例組中分別為97.9%和2.1%，兩者無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.43,OP=1.96，95%CI為0.35～10.82)。

這說明至少在我們的研究中，DNMT3B基因啟動(dòng)子區(qū)上游149位C46359T多態(tài)性與食管癌易感性之間可能無顯著的相關(guān)性。

這有可能是由于在不同的細(xì)胞組織中DNMT3B的不同剪切8子催化活性有差異［8］，或者是DNMT3B活性的抑制不能使一些細(xì)胞系中高甲基化的腫瘤抑制基因激活［21P22］，而且在不同腫瘤中，C和T所代表的風(fēng)險(xiǎn)因素也不同，如在肺癌中，DNMT3BC46359T的CT+TT基因型所患風(fēng)險(xiǎn)幾乎是CC基因型的兩倍［20］；而在乳腺癌中，CT+CC基因型風(fēng)險(xiǎn)率顯著高于TT基因型［9］，這說明在不同的腫瘤中DNMTs作用的復(fù)雜性。

本研究結(jié)果還顯示中國漢族人的基因型分布與英國、美國白種人有顯著不同（Plt;0.01）。

有關(guān)中國人群該位點(diǎn)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此CT基因型在中國漢族為2.5%［16］,北方地區(qū)為5.1%［19］，正常對(duì)照組中均未檢出CC基因型，這種分布的顯著差異的機(jī)制還沒有明確。

DNMT3B多態(tài)性的生物學(xué)功能，以及其在腫瘤發(fā)生過程中的作用還有待進(jìn)一步研究。

此位點(diǎn)與食管癌易感性的相關(guān)性還需要在其他種族中進(jìn)行研究。

【參考文獻(xiàn)】［1］呂寶忠,趙壽元.腫瘤遺傳學(xué)[M].北京：

科學(xué)出版社，1998：

98.［2］H(B(PBP,NATHANSON(P.Powpenetrancegenesassociatedwithincreasedriskforbreastcancer[J].9(urJCancer,2000,36(10)E1193P1199.［3］POND(PBA.Cancergenetics[J].Nature,2001,411(6835)E336P341.［4］(NGC,H(PMANJG,BAYPINSB.Abirdseyeviewofglobalmethylation[J].NatGetet,2000,24(2)E101P102.［5］POB(PTSON(D,((YOMAPSI(,GONZAP(SPA,etal.DifferentialmPNAexpressionofthehumanDNAmethyltransferase(DNMTs)1,3aand3bduringtheG0/G1toSphasetransitioninnormalandtumorcells[J].Nucl(icAcidsPes,2000,28(10)E2108P2113.［6］MIZUNOS,CHIJIHAT,O(AMUPAT,etal.(xpressionofDNAmethyltransferasesDNMT1,3A,and3Binnormalhematopoiesisandinacuteandchronicmyelogenousleukemia[J].Blood,2001,97(5)E1172P1179.［7］PIU(,HANGYP.(ndogenousassaysofDNAmethyltransferasesEevidencefordifferentialactivitiesofDNMT1,DNMT2,andDNMT3inmammaliancellsin10vivo[J].MolCellBiol,2003,23(8)E2709P2719.［8］O(ANOM,B(PPDH,HAB(PDA,etal.DNAmethyltransferasesDnmt3aandDnmt3bareessentialfordenovomethylationandmammaliandevelopment[J].Cell,1999,99(3)E247P257.［9］MONTGOM(PY(G,PIUMC,(CCP(SDM，etal．TheDNMT3BCTpromoterpolymorphismandriskofbreastcancerinaBritishpopulation：

aeasecontrolstudy[J]．BreastCancerPes，2004,6(4)：

390P394．［10］饒克勤，李連弟.中國惡性腫瘤危險(xiǎn)因素研究［M］.北京：

中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,2003E235P248.［11］HANGPD，ZH(NGS，ZH(NGZY，etal．Primaryadenocarcinomasofloweresophagus，esophagogastricjunctionandgastriccardia：

inspecialreferencetoChina[J]．HorldJGastroenterol，2003，9(6)：

1156P1164．［12］MOP(TOM．Diagnosisofesophagogastrictumors[J]．(ndoscopy，2003，35(1)：

36．11［13］S(OOGT，vanPtHOOPTPM，(APPINB，etal．Acommonfunctionalpolymorphism(CAsubstitutionatpositionP863)inthepromoterregionofthetumournecrosisfactoralpha(TNPPalpha)geneassociatedwithreducedcirculatinglevelsofTNPPalpha[J]．HumMolGenet,19998(8)：

1443P1449．［14］SH(NH,HANGP,SPITZMP,etal.AnovelpolymorphisminhumancytosineDNAPmethyltransferaseP3Bpromoterisassociatedwithanincreasedriskoflungcancer[J].CancerPes,2002,62(17)E4992P4995.［15］COPPINSPS，BPOO(SPD，CHA(PAVAPTIA．ADNApolymorphismdiscoveryresourceforresearchonhumangeneticvariation[J]．GenomePes，1998,8(12)：

1229P1231.［16］COPPINSA，PONJOUC，MOPTONN(，etal．Geneticepidemiologyofsinglenucleotide12polymorphisms[J]．ProcNatlAcadSciUSA，1999，96(26)：

15173P15177．［17］JON(SPA,TA(AID.TheroleofDNAmethylatio