【色氨酸的生產(chǎn)工藝綜述3900字】

色氨酸的生產(chǎn)工藝綜述目錄TOC\o"1-1"\h\u25311色氨酸的生產(chǎn)工藝綜述 159121.1發(fā)酵菌株 1125261.2培養(yǎng)基配方 143161.3無菌空氣系統(tǒng) 2138071.4淀粉的液化和糖化 4206271.5培養(yǎng)方法 565881.6發(fā)酵參數(shù) 638231.7總工藝流程 81.1發(fā)酵菌株選用谷氨酸棒桿菌基因工程菌1.2培養(yǎng)基配方（1）斜面培養(yǎng)基表2-1斜面培養(yǎng)基配方斜面培養(yǎng)基配方蛋白胨(g/L)10酵母粉(g/L)5氯化鈉(g/L)5瓊脂(g/L)15PH7.0（2）種瓶培養(yǎng)基表2-2種瓶培養(yǎng)基配方種瓶培養(yǎng)基配方蛋白胨(g/L)10酵母粉(g/L)5氯化鈉(g/L)5葡萄糖(g/L)10pH7.0（3）種子罐培養(yǎng)基表2-3種子罐培養(yǎng)基配方種子罐培養(yǎng)基配方酵母粉(g/L)1檸檬酸鈉(g/L)1.6硫酸銨(g/L)1.2葡萄糖(g/L)1.5七水合硫酸鎂(g/L)1.6七水合硫酸亞鐵(g/L)0.01維生素B1(mg/L)0.1硫酸錳(g/L)0.01pH7.0-7.2（4）發(fā)酵罐培養(yǎng)基表2-4發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方酵母粉(g/L)1磷酸二氫鉀(g/L)2硫酸銨(g/L)4檸檬酸(g/L)2七水合硫酸鎂(g/L)5葡萄糖(g/L)15一水合硫酸錳(g/L)6.3一水合硫酸鋅(g/L)7.4六水合硫酸鈷(g/L)5.6五水合硫酸銅(g/L)0.01pH7.0-7.21.3無菌空氣系統(tǒng)谷氨酸棒桿菌在發(fā)酵過程中需要氧氣，一般以空氣作為氧氣的來源。由于現(xiàn)實空氣中存在著大量的有害微生物，如果不經(jīng)過除菌環(huán)節(jié)微生物會隨空氣進入培養(yǎng)液，在一定的條件下會大量增殖，與目的菌株相互競爭從而消耗營養(yǎng)物質(zhì)，并產(chǎn)生各種非目的代謝產(chǎn)物，最終會干擾預(yù)定發(fā)酵的正常進行，使發(fā)酵產(chǎn)品的效能降低，產(chǎn)量下降，甚至造成發(fā)酵徹底失敗等嚴(yán)重事故[3]。因此為了確保純種培養(yǎng)，必須將空氣中有害微生物除去，并且能夠保持好相對濕度和適宜的溫度。由于在設(shè)計無菌空氣系統(tǒng)時要考慮刀介質(zhì)阻力、發(fā)酵靜壓以及管道阻力等影響因素，所以本設(shè)計采用加壓后的空氣壓縮機來進行供給。過濾除菌是當(dāng)今工業(yè)育種中最常用的空氣微生物除菌方法。生物處理中獲得大量無菌空氣最常用的常規(guī)方法是:一是介質(zhì)之間的孔隙大于微生物的直徑，所以需要有一定厚度的介質(zhì)濾層來達到過濾殺菌的目的，這就叫介質(zhì)過濾或相對過濾。這類過濾介質(zhì)包括棉、活性炭、玻璃纖維、有機合成纖維和燒結(jié)材料；然而，其他介質(zhì)的孔比細(xì)菌的小。當(dāng)含有細(xì)菌和其他微生物的空氣通過介質(zhì)時，微生物被截留在介質(zhì)上，實現(xiàn)過濾滅菌，有時稱為絕對過濾。然而，媒體過濾是常用的。另外，壓縮、管道輸送和過濾過程中空氣壓力和溫度的變化也會引起空氣相對濕度的變化。一旦發(fā)生凝結(jié)和水分離，過濾介質(zhì)就會吸收水分，這將大大降低過濾介質(zhì)的滅菌效率。因此，壓縮空氣中可能產(chǎn)生沉淀的水應(yīng)靠近過濾介質(zhì)前去除。圖2-1選用兩級冷卻、分離、加熱的空氣除菌流程第一階段的冷卻可以使大部分水和油變成較大的霧狀顆粒(通常冷卻到30~35℃)；第二級冷卻可以使空氣沉淀出較小的霧粒(通常冷卻到20~25℃)；第一次分離的目的是分離直徑較大、濃度較大(直徑在0um以上)的霧粒。第二次分離的目的是分離直徑較小(直徑小于5um)的氣溶膠顆粒。這種設(shè)備選型的優(yōu)點是具有相對完善的空氣消毒工藝，能夠適應(yīng)各種氣候條件，尤其是潮濕地區(qū)。在其他地區(qū)，可以根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r適當(dāng)增加或減少工藝中的設(shè)備。能充分分離油和水，使空氣達到較低的相對濕度進入過濾器，提高過濾效率。此外，其特點包括兩次冷卻、兩次分離和適當(dāng)加熱。二次冷卻可以減少油膜污染對傳熱的影響，提高傳熱系數(shù)，節(jié)約冷卻水；油、水和霧可以通過兩次分離完全分離。適當(dāng)?shù)募訜峥梢詫⒊罂諝獾南鄬穸葟?00%降低到50%~60%[4]。具體流程是對進入空壓機的空氣進行過濾。過濾掉粉塵等固體顆粒，對空壓機的正常運行和介質(zhì)的滅菌有很大的幫助。為了防止往復(fù)式壓縮機產(chǎn)生脈動，需要在過程中設(shè)置一個或幾個氣罐。最后進行無菌過濾。空氣滅菌系統(tǒng)一般采用二級過濾裝置，由兩個總過濾器(交叉使用)和子過濾器(每個發(fā)酵罐)組成，以確?？諝獾臒o菌性。1.4淀粉的液化和糖化葡萄糖作為原料用于色氨酸發(fā)酵，但所使用的發(fā)酵菌株沒有分解淀粉的功能，所以在發(fā)酵前要將淀粉水解為葡萄糖。工業(yè)上生產(chǎn)葡萄糖的方法主要有噴霧液化法和雙酶法。工藝流程包括漿液混合、液化、糖化和過濾。1.4.1調(diào)漿:攪拌速度保持在10-20r/min，加入無菌水和淀粉原料使淀粉濃度的配比達到25%，然后升溫到50-55℃，pH保持在6.0-6.5之間，加入耐高溫淀粉α-淀粉酶用量為10u（g淀粉）。1.4.2液化當(dāng)蒸汽進入噴射器和維持柱后，通過預(yù)熱溫度可以達到90-95℃，隨后淀粉乳被泵入噴射器，然后在噴射器下排出，并引入維持罐當(dāng)中。保持過程溫度始終在95-98℃之間并持續(xù)至少30分鐘，此時可以觀察到淀粉乳的碘反應(yīng)呈棕紅色，擴散迅速。1.4.3糖化糖化后，淀粉乳冷卻至60-65℃再通過螺旋換熱器，最終到達糖化罐。一般使用10%硫酸調(diào)節(jié)pH至4.2-4.5，待pH穩(wěn)定后加入糖化酶。用量為100U。糖化時間控制再24～48h，DE值在終點前達到最高值。提前15min將溫度升高到85℃從而滅活酶。1.4.4過濾由于糖化過程條件溫和，脂肪和蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)不變，因此可用板框壓濾機過濾。1.5培養(yǎng)方法本次設(shè)計使用純度為65%的液態(tài)糖作為碳源，16%的氨水作為氮源，通過液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)色氨酸。整個工藝流程大致如下：將接種后的培養(yǎng)基進行三級發(fā)酵，得到發(fā)酵液；發(fā)酵液經(jīng)樹脂柱吸附分析，得到分析溶液；對分析溶液進行一次濃縮、酸化、脫色和過濾，得到脫色溶液；脫色后的溶液經(jīng)過二次濃縮、結(jié)晶、離心分離、干燥、全混合、過篩、包裝得到色氨酸成品[5]。反應(yīng)總方程式為：4C6H12O6+4NH3+O2→2C11H12O2N2+2CO2+18H2OL-色氨酸發(fā)酵工藝包括菌種篩選、種子制備、培養(yǎng)基選擇、種子罐培養(yǎng)、發(fā)酵裝置、無菌空氣制備、產(chǎn)品分離純化、檢測、包裝和銷售。采用間歇式糖發(fā)酵工藝，以氨水為氮源，自動控制并記錄發(fā)酵溫度、溶解氧、罐壓、風(fēng)量、pH值等參數(shù)，提高產(chǎn)酸率和轉(zhuǎn)化率。采用國產(chǎn)優(yōu)良菌株發(fā)酵，采用高效膜過濾空氣凈化裝置，保證發(fā)酵生產(chǎn)的穩(wěn)定性。發(fā)酵所需的主要設(shè)備有:一級種子罐、二級種子罐、發(fā)酵罐、連消系統(tǒng)和空氣系統(tǒng)。輸入材料為葡萄糖溶液、無機鹽和固體培養(yǎng)基(酵母抽提物和檸檬酸三鈉)，出料為色氨酸發(fā)酵液。輸入的物料按照一定的配方進行消毒，待消毒結(jié)束后進入一級種子罐、二級種子罐和發(fā)酵罐[4]。1.5.1菌種活化將從冰箱中冷凍保藏的菌株放置在37℃水浴鍋內(nèi)活化2小時后，使用接種環(huán)挑取少量菌種，分區(qū)劃線接種到新斜面上，然后在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。1.5.2種子培養(yǎng)使用移液槍吸取一定量的無菌H2O，加入到剛剛活化過的斜面中，進而收集試管的懸液，在1000毫升三角瓶中，加入40克麩皮和40毫升水，混合均勻，在121℃滅菌30分鐘。然后接種，再放入30℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)3-4天，前2天每天混合兩次，這樣孢子完全成熟后就不用再混合了。使用前，用無菌水沖洗麩曲中的孢子，然后用移液管將搖瓶中的培養(yǎng)液按2%的接種量注入種子罐中，控制溫度在37℃左右，然后用NH3·H2O調(diào)pH，范圍在7.0~7.2，另外攪拌速度控制在200r/min，風(fēng)量為0.3m3/(m3·min)，罐壓保持在0.03Mpa。1.5.3發(fā)酵培養(yǎng)在種子培養(yǎng)后，用移液槍按10％接種量接種至發(fā)酵罐當(dāng)中。在一開始接種后，保持?jǐn)嚢杷俣仍?20r/min，溫度保持在31℃左右，氨水調(diào)pH在7.0~7.2，恒速流加15g/L的葡萄糖進行補料，從而使罐中糖含量保持在較高的水平。另外，在發(fā)酵過程中，如果葡萄糖的濃度降低，則可以適當(dāng)提高流速將葡萄糖流加入發(fā)酵罐中。發(fā)酵過程中使用消泡劑泡敵，每隔5-6小時就要對發(fā)酵液進行鏡檢，同時按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程，保持環(huán)境潔凈，防止染菌[5]。1.6發(fā)酵參數(shù)1.6.1溫度谷氨酸棒桿菌最適宜的生長溫度為37℃。谷氨酸棒桿菌生長一共分為四個時期：延滯期、指數(shù)期、平穩(wěn)期、衰亡期，溫度對于谷氨酸棒桿菌的生長一般呈“種罩型”曲線。發(fā)酵初期，發(fā)酵產(chǎn)物隨著細(xì)胞濃度增加而增加；到發(fā)酵中期時，發(fā)酵產(chǎn)物的生成不僅與細(xì)胞濃度有關(guān)，也與質(zhì)粒穩(wěn)定性有關(guān)。當(dāng)溫度達到36℃時，細(xì)胞濃度最高，但質(zhì)粒穩(wěn)定性被破壞；溫度28℃時，質(zhì)粒穩(wěn)定，但細(xì)菌生長緩慢，產(chǎn)量下降，因此最適溫度在28-36℃之間。調(diào)控方法：色氨酸發(fā)酵過程的溫度控制策略為:發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵0~16h,16h后緩慢升溫至36℃，加熱方式為0.5℃/h。采用發(fā)酵罐溫度順序控制方式進行自動控制[6]。1.6.2pHpH對菌體的生長、菌體的酶活性、細(xì)胞膜的通透性、培養(yǎng)基中組分的解離等都會產(chǎn)生一定影響，從而影響發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。調(diào)控方法：監(jiān)控發(fā)酵液的pH,當(dāng)pH不穩(wěn)定時，加入銨鹽或葡萄糖；主要通過加入氨水來調(diào)節(jié)。1.6.3溶氧濃度谷氨酸棒桿菌為兼性厭氧菌，發(fā)酵前期對氧氣要求較高，后期則幾乎不需要氧氣。調(diào)控方法：前期通過提高攪拌速度，或者加大通氣量來提高溶氧濃度；與之相反，后期通過降低攪拌速度，減少通氣量來降低溶氧濃度。1.6.4菌體濃度在一定濃度范圍內(nèi)，菌體濃度與發(fā)酵產(chǎn)量成正相關(guān)。即菌體濃度愈大，發(fā)酵產(chǎn)量愈大。當(dāng)菌體濃度達到一定時，此時發(fā)酵液過于粘稠，發(fā)酵液中氧氣過少，不易于產(chǎn)物的合成。

調(diào)控方法：定時檢測菌體的濃度，避免菌體過濃，影響發(fā)酵產(chǎn)物的合成。1.6.5發(fā)酵罐壓力在發(fā)酵過程中，發(fā)酵罐應(yīng)保持一定的正壓，以防止外界空氣中的外來細(xì)菌入侵而污染發(fā)酵液。同時,罐內(nèi)壓力也與培養(yǎng)基中氧氣和二氧化碳的溶解度有關(guān)，間接影響代謝。罐內(nèi)壓力一般維持在2×104～5×104Pa。1.6.6基質(zhì)濃度葡萄糖濃度過高時，會造成發(fā)酵液的pH降低，菌體生長緩慢；當(dāng)葡萄糖濃度過低時，菌體易衰老。若酵母粉濃度過高，菌體快速生長，pH上升，抑制目標(biāo)產(chǎn)物的生成；酵母粉濃度過低時，不利于菌體繁殖。調(diào)控：定時檢測培養(yǎng)基中葡萄糖、酵母粉的濃度。1.6.7泡沫發(fā)酵過程中因通氣攪拌和代謝產(chǎn)生的氣體是產(chǎn)生泡沫的原因。產(chǎn)生少量泡沫是正常的，但是當(dāng)泡沫產(chǎn)生過多時，會造成大量液體逸出，發(fā)酵液會從排氣管或密封處逸出，增加細(xì)菌污染的機會。嚴(yán)重時還會影響正常的通氣和攪拌，從而影響細(xì)菌的呼吸。調(diào)控方法：使用消泡劑同時采用機械震動使其均勻