抗獨特型抗體及相關(guān)試劑盒開發(fā)技術(shù)

抗獨特型抗體及相關(guān)試劑盒開發(fā)技術(shù)北京義翹神州科技股份有限公司SinoBiologicalInc.CONTENT抗獨特型抗體研究背景1抗獨特型抗體簡介2抗獨特型抗體及相關(guān)試劑盒開發(fā)流程3成功案例分享4SinoBiologicalInc.抗獨特型抗體研究背景01SinoBiologicalInc.1975雜交瘤技術(shù)1985噬菌體展示文庫技術(shù)1986鼠源抗體藥物上市

2000ADC藥物上市2011免疫檢查點抗體藥上市2021FDA累積獲批上市抗體藥物過百種1993嵌合型抗體藥上市1997人源化抗體藥上市2002全人源抗體藥上市2009雙特異性抗體藥上市抗體類藥物發(fā)展歷程SinoBiologicalInc.●抗體類藥物爆發(fā)式增長；

●全球抗體藥市場節(jié)節(jié)攀升；

●新型抗體藥物不斷涌現(xiàn)；SinoBiologicalInc.抗體類藥物開發(fā)的兩個必需環(huán)節(jié)藥代動力學(xué)實驗（pharmacokinetics,PK)指導(dǎo)合理用藥推進“精準(zhǔn)醫(yī)療”安全性評價有效性評價抗獨特型抗體——抗體藥物開發(fā)過程中的重要配套試劑免疫原性評價(anti-drug-antibodyassayADA

assay)SinoBiologicalInc.抗獨特型抗體簡介02SinoBiologicalInc.抗體結(jié)構(gòu)分析VHCH1VLCLCH2CH3AntigenbindingBiologicalactivityFR1FR2FR3FR4ForeignparticlebindingsiteForeignparticlebindingsiteCDR1CDR2CDR3SinoBiologicalInc.獨特型（Idiotype）抗體分子可變區(qū)上的特異抗原表位群，主要是由于超變區(qū)的氨基酸的差異決定的抗獨特型抗體（Anti-idiotypeAntibody,Anti-ID抗體）識別抗體獨特型的抗抗體抗獨特型抗體SinoBiologicalInc.抗獨特型抗體分類抗原阻斷型/競爭型Anti-ID抗體和抗體藥的結(jié)合可以被靶標(biāo)蛋白阻斷抗原非阻斷型/非競爭型Anti-ID抗體和抗體藥的結(jié)合不被靶標(biāo)蛋白阻斷靶標(biāo)蛋白Anti-ID抗體治療性抗體藥物靶標(biāo)蛋白治療性抗體藥物Anti-ID抗體SinoBiologicalInc.抗獨特型抗體的主要應(yīng)用藥代動力學(xué)研究——檢測不同狀態(tài)的抗體藥物含量抗體類藥物的免疫原性分析疫苗開發(fā)SinoBiologicalInc.藥代動力學(xué)實驗（PK）吸收中心區(qū)分布外周區(qū)代謝排除臨床前初始藥量設(shè)定分析藥物相互作用及濃度監(jiān)測臨床安全性、有效性評價改進藥物劑型、指導(dǎo)合理用藥SinoBiologicalInc.抗獨特型抗體在藥物濃度檢測中的應(yīng)用抗獨特型抗體捕獲實驗Anti-idiotypecaptureELISACaptureanti-idiotypeantibodySinoBiologicalInc.不同類型Anti-ID抗體在血藥濃度檢測中的應(yīng)用抗原阻斷型/競爭型Anti-ID抗體——檢測游離抗體藥和部分結(jié)合抗體藥抗原非阻斷型/非競爭型Anti-ID抗體——檢測總抗體藥靶標(biāo)蛋白治療性抗體藥物Anti-ID抗體SinoBiologicalInc.結(jié)合型Binding與藥物結(jié)合干擾PK、TK藥物檢測引起超敏反應(yīng)保持/清除型Sustaining/clearing與藥物形成復(fù)合物，延長/縮短藥物半衰期延長/縮短藥物暴露時間中和型Neutralizing與藥物形成復(fù)合物，阻止藥物和靶點的結(jié)合降低藥效高低免疫原性（藥物安評）：治療性藥物注入動物或人體內(nèi)后，使其產(chǎn)生抗藥抗體的反應(yīng)性ADA的類型及危害：危害程度免疫原性評價SinoBiologicalInc.藥物結(jié)構(gòu)變化聚合、降解、氧化、脫酰胺等給藥方式劑量、途徑、頻率與內(nèi)源性蛋白的序列差異生產(chǎn)純化工藝處方組分、生產(chǎn)條件受試人員個體差異遺傳因素、健康狀態(tài)儲存、冷鏈運輸各環(huán)節(jié)ADA原因多樣后果嚴(yán)重公司名稱靶點適應(yīng)癥終止階段Abbvie/RocheIL2R多發(fā)性硬化癥退市PfizerPCSK9降血脂PhaseIIITevaIL5哮喘PhaseIIIAZα4β1integrin腫瘤一線治療PhaseIIIGenentechPD-L1腫瘤一線治療PhaseIIIBMSPD1腫瘤一線治療PhaseIIISinoBiologicalInc.基于風(fēng)險的原則（Risk-based）具體問題具體對待（CaseByCase）多層次遞進式進行（Multi-TieredTestingApproach）Tier1:ScreeningTier2:ConfirmationTier3:CharacterizationFinalpositivepositivenegativenegative免疫原性評價關(guān)鍵詞SinoBiologicalInc.免疫原性檢測方法設(shè)立原則高靈敏性（<100ng/mL）；可覆蓋所有亞型ADA抗體檢測（IgG、IgM、IgE等）；Anti-ID抗體作為陽性對照抗體，建立檢測方法學(xué)驗證；設(shè)立陰性個體對照（未給藥個體、健康個體\目標(biāo)疾病群體）免疫原性評價常用檢測方法

橋聯(lián)ELISA檢測

放射免疫沉淀法(RIPA)

表面等離子共振技術(shù)(SPR)

電化學(xué)發(fā)光檢測(ECL)抗體藥Anti-ID抗體抗體藥（標(biāo)記后）SinoBiologicalInc.抗獨特型抗體及相關(guān)試劑盒開發(fā)流程03SinoBiologicalInc.Anti-ID抗體類型的選擇：單克隆抗體?多克隆抗體?項目Anti-ID單克隆抗體Anti-ID多克隆抗體主要應(yīng)用范圍PK檢測免疫原性評價制備周期20~29周11~17周優(yōu)勢單一表位特異性好批次間穩(wěn)定性好可以模擬血樣中真實情況制備周期相對較短成本低劣勢制備周期長成本相對較高不能反映血液樣本的真實情況特異性偏低批次間穩(wěn)定性低SinoBiologicalInc.1周免疫原制備9~11周動物免疫及效價檢測2-5周雜交瘤細(xì)胞融合3-5周亞克隆篩選2-4周生產(chǎn)純化2周抗體鑒定1周免疫原制備8-10周動物免疫及效價檢測1-2周抗體純化1周純化后抗體鑒定Anti-ID單克隆抗體研發(fā)流程Anti-ID多克隆抗體研發(fā)流程SinoBiologicalInc.Anti-ID抗體研發(fā)技術(shù)難點分析動物免疫免疫原的選擇；提高CDR區(qū)的免疫反應(yīng)；快速免疫；單抗制備雜交瘤融合成功率；ELISA競爭分型檢測方法；提高篩選效率的方法；純化后抗體的鑒定方案；多抗純化多克隆抗體純化方案；如何選擇純化方式；SinoBiologicalInc.動物免疫-1.免疫原選擇—IgG、F(ab)2免疫原IgGF(ab)2與同型IgG交叉反應(yīng)+++免疫原成本+++與抗體藥的識別+++單抗單次融合同時獲得兩種類型抗體的概率+++多抗純化難度+++

根據(jù)實驗具體需求，選擇有優(yōu)勢的免疫原SinoBiologicalInc.動物免疫-2.提高CDR區(qū)免疫反應(yīng)選用酶切后的F(ab)2進行免疫——減少Fc段引起的非特異性抗體比例；嘗試多種免疫佐劑——弗氏佐劑、錳佐劑、QS21、titermax等；調(diào)整免疫部位、周期；嘗試大分子蛋白偶聯(lián)后免疫(KLH等)SinoBiologicalInc.動物免疫-3.快速免疫免疫方式小鼠兔常規(guī)免疫9~11周8~10周快速免疫4~5周5~7周SinoBiologicalInc.單抗-1.提高Anti-ID單克隆抗體融合成功率電融合技術(shù)獲得更多融合成功的雜交瘤細(xì)胞增加Anti-ID抗體篩選幾率靶點PEG融合電融合靶點1<1008倍靶點2<1002倍靶點3<1503倍靶點4<100相當(dāng)靶點5040

相同脾細(xì)胞量電融合陽性克隆數(shù)量遠(yuǎn)大于PEG融合有效提高融合效率擴大抗體篩選池SinoBiologicalInc.單抗-2.Anti-ID

單克隆抗體的分型檢測辦法競爭ELISA檢測原理1競爭ELISA檢測原理2待檢抗體抗體藥小鼠IgG檢測二抗靶點蛋白抗體藥標(biāo)記后靶點蛋白待檢抗體靶點蛋白抗體藥待檢抗體人IgG檢測二抗競爭ELISA檢測原理3SinoBiologicalInc.細(xì)胞上清與純化后抗體的競爭Elisa結(jié)果一致性好單抗-3.篩選階段對Anti-ID

單抗進行初步分型:增加篩選的目的性SinoBiologicalInc.單抗-4.純化后Anti-ID單克隆抗體鑒定方案結(jié)合檢測競爭檢測競爭型抗體；非競爭型抗體配對檢測抗獨特型抗體相互配對；抗獨特型抗體與其他標(biāo)記二抗配對兔抗小鼠F(ab)2/HRP抗獨特型抗體B（標(biāo)記）抗體藥靶標(biāo)蛋白抗體藥物（血清樣品）抗獨特型抗體A抗獨特型抗體與抗體藥結(jié)合（+）；與同型人IgG/總?cè)薎gG結(jié)合（-）兔抗小鼠F(ab)2/HRP同型對照人IgG抗體藥抗獨特型抗體SinoBiologicalInc.多抗-1.Anti-ID多克隆抗體純化方案1.蛋白A捕獲總抗體2.免疫原親和純化3.總?cè)薎gG吸附4.同型人IgG吸附兩步純化法四步純化法SinoBiologicalInc.多抗-2.Anti-ID多克隆抗體不同純化方式的選擇screeningconfirmationcharacterization可以檢測總抗體針對非功能區(qū)的抗體也可能產(chǎn)生不良影響可以有目的的使用功能區(qū)抗體驗證

根據(jù)實驗階段、實驗需求的不同有針對性的選擇純化方式兩步純化法四步純化法SinoBiologicalInc.Anti-ID相關(guān)試劑盒開發(fā)流程抗體親和力篩選抗體標(biāo)記抗體配對標(biāo)曲建立樣本檢測、準(zhǔn)確性驗證檢測方法建立及樣本檢測介入抗體親和力篩選抗體配對標(biāo)曲建立樣本檢測、準(zhǔn)確性驗證試劑盒生產(chǎn)及性能評估、驗證穩(wěn)定性準(zhǔn)確性精密度靈敏度特異性試劑盒研發(fā)試劑盒生產(chǎn)、質(zhì)控高品質(zhì)的試劑盒SinoBiologicalInc.抗體藥免疫原性試劑盒“01分析方法設(shè)計“02分析方法建立“03分析方法驗證陽性對照抗體類型：多抗（推薦）或單抗種屬：臨床前（無特殊要求，多為兔源或鼠源）

臨床（食蟹猴或其它非人靈長類）基質(zhì)選擇滴度曲線范圍（棋盤法）

最小稀釋倍數(shù)（MRD）試驗條件試劑的準(zhǔn)備臨界值（篩選、確證、滴度臨界值）靈敏度（與所用陽性對照密切相關(guān)）選擇性及干擾精密度穩(wěn)定性抗體藥Anti-ID抗體抗體藥（標(biāo)記后）SinoBiologicalInc.抗體藥血藥濃度檢測試劑盒抗獨特型抗體B（標(biāo)記）抗體藥物（血清樣品）抗獨特型抗體A“01分析方法設(shè)計“02分析方法建立03分析方法驗證類型：單抗(推薦）或多抗目標(biāo)：競爭型抗體檢測游離抗體藥；非競爭型抗體檢測總抗體藥種屬：無特殊要求，多為兔源或鼠源抗體配對篩選配對抗體最佳濃度（棋盤法）

檢測靈敏度試驗條件試劑的準(zhǔn)備精密度穩(wěn)定性基質(zhì)干擾驗證特異性耐用性“治療性抗體藥濃度定量方法——配體結(jié)合實驗（LBAs）抗原捕獲抗體檢測（抗原捕獲實驗）抗原捕獲抗原檢測（橋聯(lián)實驗）抗種屬抗體捕獲&檢測（通用實驗）競爭實驗Bioanalysis(2010)2(6),1125–1140AntigenDCompetitiveassayCGenericanti-humanlgGELISACaptureantispeciesantibodyAAntigen-captureELISASubstrateDetectionantibodyTherapeuticmAbConjugatedenzymeSignal(coloredproductorlightemission)CapturetargetantigenBBridgingassayAntigenAntigenSinoBiologicalInc.成功案例分享04SinoBiologicalInc.范例-1：Anti-ID單克隆抗體特異性好SinoBiologicalInc.范例-2：Anti-ID單克隆抗體競爭分型明確項目A項目B靶蛋白用量ug/ml靶蛋白濃度

ug/mlSino