MS-275體外誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡機(jī)制分析及探析

1/1MS—275體外誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡機(jī)制分析及探析1MS275體外誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡機(jī)制分析及探析MS275體外誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡機(jī)制分析及探析[摘要]目的研究組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑MS-275對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，并初步探討其分子機(jī)制。

方法用MTT法檢測(cè)MS-275對(duì)T24細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，并觀察其有效作用濃度，采用熒光顯微鏡及原位末端標(biāo)記（TUNEL）法觀察和檢測(cè)MS-275對(duì)T24細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，采用流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)Bcl-2和Bax在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。

結(jié)果MS-275抑制T24細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）為（5.21plusmn;0.61）mu;mol/L。

4.0mu;mol/L的MS-275處理T24細(xì)胞后可觀察到典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，同時(shí)引起B(yǎng)cl-2及Bax的表達(dá)率分別下調(diào)和上調(diào)。

結(jié)論HDAC抑制劑具有體外誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的作用，其作用機(jī)制涉及Bcl-2及Bax表達(dá)的動(dòng)態(tài)改變。

[關(guān)鍵詞]膀胱癌；組蛋白去乙酰化酶；細(xì)胞凋亡[中圖分類(lèi)號(hào)]R737.14[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1673-7210（2012）10（a）-0033-03膀胱癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，每年有350000例以上的新發(fā)病例，并且有145000人死于此病[1]。

其生物學(xué)行為呈多樣性，而容易復(fù)發(fā)是其重要生物學(xué)特性。

目前對(duì)其發(fā)生、2復(fù)發(fā)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未完全明了，大部分膀胱癌在確診時(shí)是表淺性的，經(jīng)過(guò)局部手術(shù)治療后復(fù)發(fā)率為50%～70%，進(jìn)展率為15%～30%。

現(xiàn)有的傳統(tǒng)抗腫瘤藥物治療尚有一定的局限性，從新的角度尋求有效的抗腫瘤藥物有望取得突破性進(jìn)展。

組蛋白去乙?；敢种苿╤istonedeactylaseinhibitors，HDAC抑制劑）是一類(lèi)通過(guò)抑制組蛋白去乙?；福╤istonedeacetylase，HDAC）而改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的化合物，依其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為六類(lèi)，而MS-275是苯酰胺類(lèi)HDAC抑制劑中最具活性的一種化合物，其顯示出對(duì)一些血液系統(tǒng)腫瘤[2]和實(shí)體腫瘤[3]有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。

本實(shí)驗(yàn)將探討MS-275對(duì)膀胱癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用及其機(jī)制。

1材料與方法1.1細(xì)胞培養(yǎng)人膀胱癌T24細(xì)胞來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院上海生物細(xì)胞研究所，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，在含10%小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)液中培養(yǎng)，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下生長(zhǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2MTT實(shí)驗(yàn)T24細(xì)胞以5times;104/mL、100mu;L/孔，接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，分別加入濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mu;mol/L的MS-275作為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組不加MS-275，空白對(duì)照組為單純DMEM培養(yǎng)液，每組各設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

繼續(xù)培養(yǎng)48h，每孔加入5g/L的MTT溶液10mu;L，再培養(yǎng)4h，3吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加100mu;L二甲基亞砜（DMSO），酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，選擇492nm波長(zhǎng)，用空白對(duì)照組調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度）times;100%。

以細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與藥物濃度的對(duì)數(shù)作圖，在圖上求出MS-275對(duì)T24細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）值。

選取接近于IC50值的濃度用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3熒光顯微鏡觀察凋亡的形態(tài)學(xué)變化將T24細(xì)胞以1times;105/孔接種于6孔培養(yǎng)板，觀察細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)良好后，加入濃度為4.0mu;mol/L的MS-275作為實(shí)驗(yàn)組，非藥物處理組作為對(duì)照組，繼續(xù)分別培養(yǎng)12、24、48h，細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化收集后，以磷酸鹽緩沖液（PBS）調(diào)整細(xì)胞密度為1times;106/mL，制成單細(xì)胞懸液，取95mu;L細(xì)胞懸液，加人100mu;g/ml的吖啶橙染液5mu;L混勻，取10mu;L混合液于載玻片上，加蓋玻片后于熒光顯微鏡（OlympusBX60）下（515nm激發(fā)光）觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并攝片。

畢業(yè)論文1.4原位末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測(cè)細(xì)胞凋亡4mu;mol/L的MS-275分別處理細(xì)胞12、24、48h，設(shè)陰性對(duì)照，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞懸液，做細(xì)胞涂片，行TUNEL法處理及染色，并以二氨基聯(lián)苯胺顯色。

細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，分析細(xì)胞凋亡率。

1.5流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax的變化4mu;mol/L的MS-275分別4處理細(xì)胞12、24、48h，收集后4%多聚甲醛固定，PBS液漂洗2次，加入1.5mL破膜劑透化15min后，離心去上清，重懸于150mu;L破膜劑中，分別加入Bcl-2和Bax的單克隆抗體，留取空白對(duì)照（不加單抗），避光反應(yīng)30min，PBS漂洗2次，每管加入FITC熒光標(biāo)記的二抗，避光反應(yīng)30min，PBS漂洗2次，上FCM檢測(cè)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)plusmn;標(biāo)準(zhǔn)差（xplusmn;s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果2.1MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果論文代寫(xiě)經(jīng)MTT法測(cè)定，濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mu;mol/L的MS-275處理T24細(xì)胞48h后，細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為（4.59plusmn;2.37）%、（9.86plusmn;6.74）%、（22.82plusmn;7.55）%、（41.17plusmn;6.14）%、（65.02plusmn;6.21）%，通過(guò)作圖求得IC50為（5.21plusmn;0.61）mu;mol/L。

選用接近IC50的4.0mu;mol/L濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度。

2.2熒光顯微鏡觀察結(jié)果對(duì)照組基本為正常細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，胞核DNA呈現(xiàn)黃綠色均勻彌散熒光。

MS-275處理12h和24h凋亡細(xì)胞逐漸增多，48h后出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，細(xì)胞呈現(xiàn)核固縮，呈現(xiàn)致密濃染的黃綠色熒光，部分細(xì)胞表現(xiàn)為核碎裂，還可見(jiàn)典型的出泡現(xiàn)象。

見(jiàn)圖1。

52.3MS-275誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡率（AI）的升高M(jìn)S-275誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡呈明顯的時(shí)間依賴(lài)性，T24細(xì)胞的凋亡率隨MS-275作用時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。

MS-275作用12、24、48h的AI分別為（9.52plusmn;2.61）%、（17.76plusmn;3.75）%和（37.5plusmn;5.26）%，AI在MS-275作用12h以上各組，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。

2.4MS-275對(duì)Bcl-2和Bax表達(dá)的影響MS-275作用6、12h，T24細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達(dá)率即出現(xiàn)明顯降低，而同時(shí)Bax蛋白的表達(dá)率出現(xiàn)明顯升高（Plt;0.05或Plt;0.01）；24hBax的蛋白表達(dá)率逐漸降低（Plt;0.01）；此后隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Bcl-2的蛋白表達(dá)率逐漸升高，而B(niǎo)ax的蛋白表達(dá)率逐漸降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。

見(jiàn)表1。

論文代寫(xiě)3討論誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是HDAC抑制劑抗腫瘤作用的重要機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)用熒光染色法及TUNEL法觀察到，微摩爾數(shù)量級(jí)的MS-275即可誘導(dǎo)T24細(xì)胞出現(xiàn)特征性的凋亡形態(tài)學(xué)改變，并且隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量呈增多趨勢(shì)。

隨后的實(shí)驗(yàn)對(duì)其誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

抗腫瘤治療可誘發(fā)腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞內(nèi)的損傷信號(hào)起反應(yīng)，而細(xì)胞是否凋亡很大程度上決定于Bcl-2家族蛋白之間的相互作用[4]。

Bcl-2是Bcl-2基因家族中調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要分子，能廣泛抑制各種凋亡6誘導(dǎo)因素引發(fā)的凋亡，其很可能影響凋亡最終通路上的中心環(huán)節(jié)。

另一個(gè)Bcl-2家族蛋白Bax是重要的異二聚體伴分子，可與Bcl-2構(gòu)成異二聚體，而B(niǎo)ax自身組成同二聚體。

Bcl-2必須結(jié)合Bax才能發(fā)揮作用。

Bcl-2與Bax蛋白量的比率決定異二聚體（Bcl-2/Bax）與同二聚體（Bax/Bax）的比值，這對(duì)決定細(xì)胞的凋亡易感性起關(guān)鍵作用[5]。

本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果表明，MS-275作用T24細(xì)胞后Bcl-2的表達(dá)減弱，Bax的表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明MS-275可下調(diào)Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，這與HDAC抑制劑誘導(dǎo)其他惡性腫瘤細(xì)胞凋亡時(shí)對(duì)凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響相一致[6-7]。

本實(shí)驗(yàn)還觀察到MS-275引起B(yǎng)ax表達(dá)的改變較Bcl-2的改變更明顯，而由于Bcl-2和Bax表達(dá)的改變是同步的，這樣就引起B(yǎng)ax/Bcl-2發(fā)生更顯著的變化。

更重要的一點(diǎn)在于，凋亡率發(fā)生顯著變化之前，Bcl-2和Bax的表達(dá)即已發(fā)生顯著的改變，這更表明Bcl-2和Bax表達(dá)的改變是MS-275誘導(dǎo)凋亡的啟動(dòng)環(huán)節(jié)上的作用因素。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HDAC抑制劑MS-275通過(guò)誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用，Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)分別下調(diào)和上調(diào)是其誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

HDAC抑制劑為膀胱癌的治療提供了新的思路。

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