各類高效液相色譜法

高效液相色譜法

HighPerformanceLiquidChromatography

分析化學(xué)教研室嚴(yán)拯宇高效液相色譜法概述1基本原理2各類高效液相色譜法3固定相4流動(dòng)相5高效液相色譜儀6小結(jié)習(xí)題及解答一、概述高效液相色譜法：以經(jīng)典液相色譜為基礎(chǔ)，在氣相色譜的理論和實(shí)驗(yàn)方法基礎(chǔ)上建立的一種分離分析方法。簡(jiǎn)稱：HPLC；HRLC；HSLC；UPLC

超高效液相色譜（UltraPerformanceLiquidChromatography）與經(jīng)典LC相比——高效

高效填料：3～5μm

高壓泵輸液

高靈敏度的檢測(cè)器:在線檢測(cè)一、概述分析對(duì)象流動(dòng)相差別GC能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品，占有機(jī)物的20%惰性氣體HPLC不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，占有機(jī)物的80%液體，種類較多，選擇余地廣HPLC與GC區(qū)別一、概述HPLC儀器示意圖一、概述HPLC儀器圖SHIMAZUAGILENTWATERS一、概述特點(diǎn)

適用范圍廣

高效

高速

高靈敏度（主要用UV5×10-10g/ml）

流動(dòng)相選擇范圍寬

柱可以反復(fù)使用（可用1-2年）

流動(dòng)組分易收集

安全高效液相色譜法概述1基本原理2各類高效液相色譜法3固定相4流動(dòng)相5高效液相色譜儀6二、基本原理范氏方程（vanDeemterequation)：

GC：填充柱

H=A+B/μ+Cμ

HPLC：

H=A+Cμ

原因：T↓；η↑；μ↑→

忽略B/μ二、基本原理GC和HPLC的H-u圖1B/μ2Cμ3A4HPLC的μopt

5GC的μopt二、基本原理HPLC： H=A+Cμ

A=2λdρ C=Cm+Csm影響因素：λ↓

選球形固定相，高壓、勻漿裝柱法dρ↓

選粒徑小的化學(xué)鍵合相C↓ 選粘度小、低流速的流動(dòng)相范氏方程（vanDeemterequation)二、分離度及影響因素：又可：

討論如何由n、α、k來改變R1、

k↑，R↑，k最適宜范圍1<k<52、改變?chǔ)痢兎彘g距

α↑，↑R↑在GC主要通過改變固定相（∵載量一定），而在HPLC中，主要通過改變流動(dòng)相。3、改變n、

a、減小顆粒直徑dρ↓b、提高裝柱技術(shù)（均勻）

c、流動(dòng)相η↓（∵低粘度流動(dòng)相可以增大Dm）

d、線速度μ↓（減小傳質(zhì)阻抗引起H）

e、增加柱長(zhǎng)L（但太長(zhǎng)，柱壓大，壽命短）高效液相色譜法概述1基本原理2各類高效液相色譜法3固定相4流動(dòng)相5高效液相色譜儀6三、各類高效液相色譜法液固吸附色譜法（LSC）

1液液分配色譜法（LLC）2化學(xué)鍵合相色譜法（BPC）3三、各類高效液相色譜法液固吸附色譜法分離機(jī)理:組分分子與流動(dòng)相分子競(jìng)爭(zhēng)吸附劑表面活性中心影響k的因素：

與硅膠親和力大的溶質(zhì)k大，tR大

控制溶劑的極性，可調(diào)整tR(常用多元體系流動(dòng)相)溶劑的極性愈大，洗脫力愈強(qiáng)，k↓.tR↓)三、各類高效液相色譜法液液分配色譜法分離機(jī)制：利用組分在兩相中分配系數(shù)的差異分類:反相色譜RPLC固定液極性<流動(dòng)相極性正相色譜NPLC固定液極性>流動(dòng)相極性三、各類高效液相色譜法液液分配色譜法固定相：載體可用Ｌ－Ｓ色譜中的吸附劑；

Ｇ－Ｌ色譜中的固定液都可采用（常用的有角鯊?fù)?、ＰＥＧ、十八烷等）流?dòng)相：反相色譜RPLC流動(dòng)相極性增大，ｋ增大，tR大極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱正相色譜NPLC流動(dòng)相極性增大，ｋ減少，tR小極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱三、各類高效液相色譜法化學(xué)鍵合相色譜法(chemicalbondedphasechromatography,BPC)通過化學(xué)反應(yīng)將固定液有機(jī)分子鍵合在載體表面所形成的柱填充劑。反相鍵合相離子抑制正相鍵合相離子對(duì)三、各類高效液相色譜法反相鍵合相色譜法(RBPC)固定相：非極性的鍵合相 如:十八烷基硅烷鍵合相（ODS；C18柱)固定相的最佳使用ｐＨ：２～８流動(dòng)相：極性大的流動(dòng)相 如:甲醇-水或乙腈-水流動(dòng)相極性與k的關(guān)系:

極性↑，洗脫能力↓，k↑，組分tR↑

極性大的組分先出柱應(yīng)用：非極性--中等極性組分，應(yīng)用范圍最廣。三、各類高效液相色譜法2.

正相鍵合相色譜法(NBPC)固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相流動(dòng)相：極性小的底劑（烷烴）+極性調(diào)節(jié)劑

流動(dòng)相極性與k的關(guān)系： 流動(dòng)相極性↑，洗脫能力↑，組分tR↓，k↓

結(jié)構(gòu)相近組分，極性大的組分后出柱三、各類高效液相色譜法3.

離子對(duì)色譜法(IPC,PIC)分離機(jī)制：把離子對(duì)試劑加入極性流動(dòng)相中，被分析的離子在流動(dòng)相中與離子對(duì)試劑（反離子）生成不帶電荷的中性離子時(shí)，從而增加在非極性固定相中的溶解度，使分配系數(shù)增大，而改變分離效果。

流動(dòng)相 固定相

B+H+BH+

+RSO3Na

RSO-3+Na+

[BH+.RSO-3][BH+.RSO-3]

中性離子對(duì) ↗增加了在非極性固定相中溶解度。機(jī)理：三、各類高效液相色譜法常用離子對(duì)試劑：

分析對(duì)象離子對(duì)試劑例如堿烷基磺酸鈉C5、C6、C7、C8磺酸鈉,SDS酸四丁基季胺鹽四丁基胺磷酸鹽（TBA）三、各類高效液相色譜法4.

離子抑制色譜法(ISC)分離機(jī)制：通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH，抑制組分離解，增加它在固定相中的溶解度，以達(dá)到分離有機(jī)弱酸，弱堿的目的適用范圍：3.0≤pKa≤7.0的弱酸

7.0≤pKa≤8.0的弱堿抑制劑:

弱酸（HAc）、弱堿（NH3·H2O）或緩沖液三、各類高效液相色譜法4.

離子抑制色譜法(ISC)影響ｋ的因素：

與凡在反相色譜中的影響因素，此處同樣影響。

pH的影響弱酸：pH<pKa時(shí)，k↗,tR增大（以分子形式，固定相中多）

pH>pKa時(shí)，k↘,tR減少

(以離子形式，流動(dòng)相中多)弱堿與上恰相反。pH<pKbtR↘ pH>pKbtR↗ 總之，pH應(yīng)在2～8，超出將會(huì)腐蝕儀器，流路系統(tǒng)。HPLC概述1基本原理2各類高效液相色譜法3固定相4流動(dòng)相5高效液相色譜儀6四、固定相液-固色譜固定相硅膠

特點(diǎn)

表面多孔硅膠(YBK)

易裝柱，柱效不高，柱容量小

無定形全多孔硅膠（YWG）柱效高，柱容量大，價(jià)廉，但硅膠要?jiǎng)驖{）

球形全多孔硅膠（YQG）具YWG的優(yōu)，具渦流擴(kuò)散小，滲透性好

堆積硅珠 傳質(zhì)阻抗小，柱容量大

四、固定相液-固色譜固定相高分子多孔小球：YSG（柱效低η103）

又稱有機(jī)膠：苯乙烯與二乙烯苯交聯(lián)而成。用途：分離芳烴、雜環(huán)、甾體、生物堿……四、固定相化學(xué)鍵合相特點(diǎn)：不易流失;熱穩(wěn)定性好;化學(xué)性能穩(wěn)定載樣量大;適于梯度洗脫分類:非極性鍵合相：ODS中等極性鍵合相：醚基鍵合相極性鍵合相：氨基、氰基鍵合相HPLC概述1基本原理2各類高效液相色譜法3固定相4流動(dòng)相5高效液相色譜儀6五、流動(dòng)相要求：與固定液不反應(yīng);對(duì)樣品有良好溶解度粘度小;與檢測(cè)器匹配溶劑不同，與分子間作用力不同，有可能使組分的R不同，改變?nèi)軇┑臉O性，對(duì)組分的洗脫能力改變，tR改變，實(shí)驗(yàn)時(shí)可適當(dāng)配比，以至得到較適宜的R。五、流動(dòng)相洗脫方式:等度洗脫(isocraticelution)恒定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫梯度洗脫(gradientelution)在一個(gè)分析周期內(nèi)不斷改變流動(dòng)相的比例優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便，柱易再生；缺點(diǎn)：不能用于復(fù)雜組分的分離

優(yōu)點(diǎn)：縮短分析周期；提高分離能力；改善峰形；增加靈敏度缺點(diǎn)：基線漂移五、流動(dòng)相HPLC概述1基本原理2各類高效液相色譜法3固定相4流動(dòng)相5高效液相色譜儀6六、高效液相色譜儀輸液泵進(jìn)樣器色譜柱檢測(cè)器工作站高效液相色譜儀HPLC六、高效液相色譜儀輸液泵→進(jìn)樣器→色譜柱→檢測(cè)器→工作站泵： 恒壓泵 恒流泵:柱塞往復(fù)泵六、高效液相色譜儀輸液泵→進(jìn)樣器→色譜柱→檢測(cè)器→工作站六通閥：優(yōu)勢(shì)：進(jìn)樣量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可帶壓進(jìn)樣。六、高效液相色譜儀輸液泵→進(jìn)樣器→色譜柱→檢測(cè)器→工作站色譜柱：由柱管(不銹鋼管)和固定相組成分析柱 φ2-4.6mm L10-25cm

常量柱

φ1-1.5mm L10-20cm

常微量柱制備柱 φ20-50mm L3-25cm

六、高效液相色譜儀輸液泵→進(jìn)樣器→色譜柱→檢測(cè)器→工作站檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器熒光檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器其它檢測(cè)器六、高效液相色譜儀輸液泵→進(jìn)樣器→色譜柱→檢測(cè)器→工作站檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，精密度、線性范圍好，可用于梯度洗脫。缺點(diǎn)：樣品組分應(yīng)吸收紫外光；要考慮溶劑的極限波長(zhǎng)。六、高效液相色譜儀輸液泵→進(jìn)樣器→色譜柱→檢測(cè)器→工作站六、高效液相色譜儀T/min波長(zhǎng)(nm)色譜－光譜圖六、高效液相色譜儀輸液泵→進(jìn)樣器→色譜柱→檢測(cè)器→工作站檢測(cè)器:2.熒光檢測(cè)器優(yōu)點(diǎn)：靈敏度比紫外更高。檢測(cè)限1×10-10g/ml缺點(diǎn)：只能用于產(chǎn)生熒光或其衍生物能發(fā)熒光的物質(zhì)六、高效液相色譜儀輸液泵→進(jìn)樣器→色譜柱→檢測(cè)器→工作站2489UVD2414RID2424ELSD2465ECDWATERSWATERS第七節(jié)定性、定量分析一、定性分析：

1、tR:γ12——

相對(duì)保留值=

2、化學(xué)鑒定：對(duì)HPLC流出組分收集，用專屬性化學(xué)反應(yīng)對(duì)收集的分離物質(zhì)組分進(jìn)行定性。

3、聯(lián)機(jī)技術(shù)：HPLC—MS、HPLC—FTIR

質(zhì)譜富利葉轉(zhuǎn)換紅外光譜第七節(jié)定性、定量分析

1、外標(biāo)法：以試樣的標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照物質(zhì)，相對(duì)比較求含量。（1）工作曲線法：用待測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)品配制一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液(Ci)s，準(zhǔn)確進(jìn)樣，測(cè)量峰面積(Ai)s或峰高(hi)s，與(Ci)s繪制工作曲線，利用此曲線或它的回歸方程，計(jì)算樣品溶液的含量。（2）外標(biāo)一點(diǎn)法：（與氣相同）二、定量分析：與氣相色譜同。2、內(nèi)標(biāo)法：內(nèi)標(biāo)選擇同氣相。

（1）工作曲線法：在待標(biāo)準(zhǔn)溶液系列中，同體積加入相同量的內(nèi)標(biāo)物、進(jìn)樣，分別測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)物與內(nèi)標(biāo)物的A或h，以Ai/As~(Ci)s作圖。（2）內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法：在藥物分析中，校正因子常常不知，則先配已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品，加入一定內(nèi)標(biāo)，再將內(nèi)標(biāo)按同量加入同體積樣品中，分別進(jìn)樣。（Ci%）樣品=3、校正因子法：第一步：精稱被測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)品mig，加一定精稱L內(nèi)標(biāo)Msg配液進(jìn)樣。由二者峰面