IL-2及抗人膀胱癌-抗CD3雙功能抗體協(xié)同細(xì)胞毒性作用探究

1/1IL-2及抗人膀胱癌-抗CD3雙功能抗體協(xié)同細(xì)胞毒性作用探究1IL-2及抗人膀胱癌/抗CD3雙功能抗體協(xié)同細(xì)胞毒性作用探究IL-2及抗人膀胱癌/抗CD3雙功能抗體協(xié)同細(xì)胞毒性作用探究【摘要】目的探索膀胱移行細(xì)胞癌治療的新方法。

方法制備抗人膀胱癌/抗CD3雙功能抗體,測定其與IL-2協(xié)同增強(qiáng)LAK細(xì)胞對膀胱癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性,以CD3單抗、膀胱癌單抗、二種單抗混合物及RPMI-1640作對照。

結(jié)果雙功能抗體與單抗相比,能顯著提高LAK細(xì)胞對膀胱癌細(xì)胞的殺傷作用;雙抗加入IL-2后,LAK細(xì)胞毒性得到顯著的提高,IL-2也能增強(qiáng)CD3單抗和膀胱癌單抗的細(xì)胞毒性。

結(jié)論抗人膀胱癌/抗CD3雙功能抗體與IL-2協(xié)同可顯著提高LAK細(xì)胞對膀胱癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。

【關(guān)鍵詞】雙功能抗體IL-2膀胱癌LAK細(xì)胞中國圖分類號:R737.14文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1005-0515(2010)08-064-02Studyoncooperativeactionofbispecificantibody(anti-humanbladdercancer/anti-CD3)andIL-2oncytotoxicityofLAKcells【Abstract】ObjectiveTostudyanewmethodforimprovingtherapeuticeffectonhumanbladdercarcinoma.MethodsCytotoxicityofLAKcellsagainst2bladdercancercellsenhancedbybispecificantibody(anti-humanbladdercancer/anti-CD3)andIL-2wasexamined,comparingwithcontrolgroups.ResultsCytotoxicityofLAKcellsagainstbladdercarcinomacellscouldbemarkedlyenhancedbybispecificantibodycomparedwithanti-CD3andanti-humanbladdercancermonoclonalantibody.WhenLAKcellsincubatingwithIL-2,itscytotoxicityenhancedbybispecificantibodywashigher.ConclusionBispecificantibodyandIL-2couldmarkedlyenhancecytotoxicityofLAKcellsagainstbladdercancercells.【KeyWords】BispecificantibodyInterleukin-2;Bladdercancer;Lymphokineactivatedkillercells膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,以美國為例,2002年有56500例新診病例[1]。

目前以雙功能抗體(Bispecificantibody,BsAb)為代表的主動免疫生物治療,被稱為腫瘤治療的第四模式,是近年來較有希望的一種特異性免疫療法[2]。

抗人膀胱癌/抗CD3雙功能抗體能同時識別T淋巴細(xì)胞亞群上CD3分子和膀胱移行細(xì)胞癌(以下簡稱:膀胱癌)細(xì)胞膜表面相關(guān)抗原的抗體,它既能激活T淋巴細(xì)胞及3增強(qiáng)其細(xì)胞毒活性,又有特異性地將活化的T淋巴細(xì)胞引導(dǎo)至膀胱癌細(xì)胞,并產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。

IL-2是LAK細(xì)胞所必需的細(xì)胞因子,具有增強(qiáng)LAK細(xì)胞,激活其細(xì)胞毒性的作用[3]。

本實(shí)驗(yàn)對IL-2在抗人膀胱癌/抗CD3雙功能抗體的細(xì)胞毒性中的作用進(jìn)行了研究。

1..材料與方法1.1材料抗人膀胱癌的單克隆抗體腹水,吉林大學(xué)第二醫(yī)院饋贈。

抗CD3的單克隆抗體腹水,由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室提供。

按辛酸-硫酸胺法純化,參照Nitta的方法[5]。

取已純化的抗人膀胱癌的單抗,放檸檬酸緩沖液中透析過夜,按酶:單抗=1:4(w/w)加入胃蛋白酶作用18小時,滴加1mol/L的NaHCO3使反應(yīng)物pH值為8.0,終止酶反應(yīng)。

SephadexG-150凝膠柱層析,核酸蛋白儀280nm波長監(jiān)測蛋白峰,收集器分段收集抗體的F(ab`)2片段后,聚乙二醇適當(dāng)濃縮。

CD3單抗F(ab`)2片段的制備同上。

取抗人膀胱癌的單抗的F(ab`)2片段,加入終濃度為0.5mmol/L的二硫蘇糖醇(DTT,購自Sigma),37℃作用30分鐘。

SephadexG-25凝膠柱層析,225nm監(jiān)測并分段收集Fab`片段,適當(dāng)濃縮。

同樣方法收集CD3單抗Fab`片段。

取CD3單抗Fab`片段,加入終濃度為0.5mmol/L的雙功能偶聯(lián)劑5,5`-二硫代-雙2硝基苯酸(DTNB,購自4Sigma),37℃作用30分鐘后SephadexG-25凝膠柱層析,225nm監(jiān)測,并分段收集CD3單抗Fab`片段與DTNB反應(yīng)所得的Fab`-NB片段。

將抗人膀胱癌的單抗的Fab`和CD3單抗Fab`-NB片段按1:1混合,37℃反應(yīng)4小時,反應(yīng)物用SephadexG-150凝膠柱層析,280nm監(jiān)測,分段收集雜合的F(ab`)2片段,測定雙抗?jié)舛群?置-20℃冰箱保存。

1.2.效靶細(xì)胞的制備取正常人和膀胱癌病人(術(shù)后病理確診)的靜脈肝素抗凝血50ml,淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離出單核細(xì)胞,RPMI1640液洗一次,放入含終濃度為1000U/mlIL-2的RPMI1640(含10%小牛血清)培養(yǎng)液中,置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)72小時。

以人膀胱癌BIU-87細(xì)胞[6]作為靶細(xì)胞,用RPMI1640(含10%小牛血清)培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。

1.3.細(xì)胞毒性的檢測如表1分組。

分別收集BIU-87細(xì)胞1106,RPMI1640洗后,加入6.4105Bq的3H-TdR,培養(yǎng)4小時,Hanks液洗滌二次,RPMI1640調(diào)細(xì)胞濃度為1.25105/ml。

收集LAK細(xì)胞,用RPMI1640洗后,按效、靶細(xì)胞10:1調(diào)LAK細(xì)胞濃度為1.25106/ml。

取96孔培養(yǎng)板,每孔加LAK細(xì)胞100l,加終濃度為1g/ml的雙抗50l,實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為100U/ml的IL-225l,對照組加入RPMI5164025l,37℃5%CO2培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)4小時后每孔加入已標(biāo)記好的BIU-87細(xì)胞100l,培養(yǎng)箱中作用18小時,然后棄上清液,每孔再加0.25%胰蛋白酶50l,20分鐘后,用收集器將細(xì)胞收集在49#玻璃纖維濾片上,37℃烘干,加閃爍液置液閃儀中測定cpm值。

以RPMI1640+靶細(xì)胞為空白對照組。

取4樣本均值計算細(xì)胞毒活性,公式為:細(xì)胞毒活性(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組cpm/空白對照組cpm)100%。

1.4.統(tǒng)計學(xué)方法采用t檢驗(yàn),P3..討論隨著分子生物學(xué)和免疫技術(shù)的飛速發(fā)展,雙功能抗體的研制成為熱點(diǎn),它作為一種新的二次導(dǎo)向系統(tǒng)在臨床治療中具有潛在的應(yīng)用價值[7]。

迄今已得到許多有價值的雙功能抗體產(chǎn)物,并已進(jìn)入臨床應(yīng)用[8]。

抗人膀胱癌/抗CD3雙功能抗體的一臂能利用抗CD3單抗的功能,激活T淋巴細(xì)胞的增殖活化,并增強(qiáng)其細(xì)胞毒性,活化的T淋巴細(xì)胞上的IL-2受體表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)后,加入IL-2,可引起機(jī)體各殺傷效應(yīng)細(xì)胞的一系列活化反應(yīng);另一臂能利用抗人膀胱癌單抗具有6與膀胱癌細(xì)胞膜表面抗原相結(jié)合的作用,將這些效應(yīng)殺傷細(xì)胞特異地導(dǎo)向膀胱癌細(xì)胞,并對其進(jìn)行殺傷,且這種殺傷作用是非MHC限制的[9],故能解決單純使用LAK細(xì)胞和IL-2治療所出現(xiàn)的問題,如LAK細(xì)胞為廣譜和多克隆殺傷細(xì)胞,對膀胱癌細(xì)胞缺乏特異性和體內(nèi)運(yùn)用時不能被增殖及活化等。

本研究結(jié)果提示,不同來源的LAK細(xì)胞,單獨(dú)加入抗人膀胱癌單抗或抗CD3抗體后,再加入IL-2,LAK細(xì)胞毒性均有顯著提高;當(dāng)抗人膀胱癌單抗或抗CD3抗體混合加入后,再加入IL-2,其細(xì)胞毒性雖有顯著提高,但與單獨(dú)加入抗人膀胱癌單抗或抗CD3抗體的作用相比并沒有顯著的差異;雙抗和IL-2作用后的細(xì)胞毒性,顯著高于任何單一抗體及二者混合物。

說明雙抗的作用并不是二種單抗作用的簡單相加,可能與雙抗的特異導(dǎo)向功能有關(guān)。

另外,加入單抗、雙抗等增強(qiáng)因子后,膀胱癌患者的LAK細(xì)胞對BIU-87細(xì)胞的體外殺傷作用低于正常人的LAK細(xì)胞,提示抗人膀胱癌/抗CD3雙功能抗體如果使用于臨床,還需加用其它免疫增強(qiáng)劑,才有可能時患者的免疫狀態(tài)恢復(fù)到正常人的水平。

膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,初發(fā)時80%為表淺癌,治療后易復(fù)發(fā),且復(fù)發(fā)后20-30%將進(jìn)展為浸潤癌[10]。

這種高發(fā)病趨勢及易復(fù)發(fā)進(jìn)展的特性決定了早期診斷和術(shù)后合理有效治療的重要性。

通過本實(shí)驗(yàn),我們認(rèn)為抗人膀胱癌/抗CD3雙功能抗體與IL-2的合用,可能是膀胱癌綜7合治療的有效途徑之一。

參考文獻(xiàn)[1]Laufer.M,Ramalingam.S,Schoenberg.MP,et.al.Intravesicalgemcitabinetherapyforsuperficialtransitionalcellcarcinomaofthebladder:aphaseIandpharmacokineticstudy[J].JClinOncol,2003,21:697-703.[2]LuD,JimenezX,ZhangH,etal.Di-diabody:anoveltetravalentbispecificantibodymoleculebydesign.JImmunolMethods,2003,279:219-232.[3]TrichieriG.Interleukin-2andtheregulationofinnateresistanceandadaptiveimmunity[J].NatRevImmunol,2003,3:133-146.[4]范海濤,劉祿成,朱德淳,等.抗人膀胱癌抗獨(dú)特型抗體的制備和鑒定.臨床泌尿外科雜志,2002,17:553-555.[5]NittaT,YagitaH,AzumaT,etal.BispecificF(ab`)2monomerpreparewithanti-CD3andanti-tumormonoclonalantibodiesismostpotentofcytolysisofhumanTcells.EurTImmunol,1989,19:1437.[6]劉祿成,郭航,范海濤,等.抗人膀胱癌/抗VEGF雙功8能基因抗體制備及體外效應(yīng)研究.中國免疫學(xué)雜志.2003,19:605-606.[7]ZuoZ,JimenezX,WitteL,etal.AnefficientroutetotheproductionofanIgG-likebispecificantibody.ProteinEng,2000,13:36