蛋白質(zhì)研究技術(shù)

關(guān)于蛋白質(zhì)研究技術(shù)蛋白質(zhì)的兩性電離

蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。第2頁,共126頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達(dá)1～100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。*蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷水化膜第3頁,共126頁，星期六，2024年，5月+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉第4頁,共126頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)的紫外吸收

由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定。第5頁,共126頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)的分離純化方法

透析(dialysis)

利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。第6頁,共126頁，星期六，2024年，5月

丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀*丙酮沉淀:

低溫進(jìn)行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。

*鹽析(saltprecipitation)：將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。*免疫沉淀法：將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應(yīng)的抗原蛋白，并形成抗原抗體復(fù)合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白。

第7頁,共126頁，星期六，2024年，5月第8頁,共126頁，星期六，2024年，5月電泳

蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負(fù)極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù),稱為電泳(elctrophoresis)。第9頁,共126頁，星期六，2024年，5月幾種重要的蛋白質(zhì)電泳SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS）：常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。第10頁,共126頁，星期六，2024年，5月第11頁,共126頁，星期六，2024年，5月第12頁,共126頁，星期六，2024年，5月等電聚焦電泳（isoelectricfocusing，IEF）通過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。pH梯度以兩性電解質(zhì)ampholyte（脂肪族多胺和多羧同系物）在外電場作用下自然形成。第13頁,共126頁，星期六，2024年，5月

雙向凝膠電泳two-dimensionalelectrophoresis

第14頁,共126頁，星期六，2024年，5月第15頁,共126頁，星期六，2024年，5月層析(chromatography)

原理待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。第16頁,共126頁，星期六，2024年，5月層析的主要設(shè)備第17頁,共126頁，星期六，2024年，5月常見色譜柱第18頁,共126頁，星期六，2024年，5月自動分步收集器第19頁,共126頁，星期六，2024年，5月離子交換層析ionexchangechromatography

離子交換層析法是利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。電荷不同的蛋白質(zhì)，對管柱上的離子交換劑有不同的親和力，改變沖洗液的離子強(qiáng)度和pH值，物質(zhì)就能依次從層析柱中分離出來。

第20頁,共126頁，星期六，2024年，5月離子交換層析法大致分為5個步驟

離子擴(kuò)散到樹脂表面

離子通過樹脂擴(kuò)散到交換位置

在交換位置進(jìn)行離子交換；被交換的分子所帶電荷愈多，它與樹脂的結(jié)合愈緊密，也就愈不容易被其它離子取代

被交換的離子擴(kuò)散到樹脂表面

沖洗液通過，被交換的離子擴(kuò)散到外部溶液中

第21頁,共126頁，星期六，2024年，5月離子交換層析的原理第22頁,共126頁，星期六，2024年，5月凝膠過濾(gelfiltration)凝膠過濾色譜亦稱凝膠色譜、排阻色譜或分子篩，是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種方法。凝膠色譜的機(jī)理是分子篩效應(yīng)，凝膠顆粒在合適的溶劑中浸泡，充分吸脹后裝入色譜柱內(nèi)，加入欲分離的混合物后，再以同一溶劑洗脫。在洗脫過程中，大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外；而小分子可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，路徑長、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合樣品如同“過篩”一樣，因分子大小的不同得以彼此分開。

第23頁,共126頁，星期六，2024年，5月凝膠過濾的作用機(jī)制第24頁,共126頁，星期六，2024年，5月

凝膠過濾的過程第25頁,共126頁，星期六，2024年，5月超速離心

超速離心法(ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測定蛋白質(zhì)的分子量。高速：25000rpm超速：50000-120000rpm第26頁,共126頁，星期六，2024年，5月第27頁,共126頁，星期六，2024年，5月CsCl密度剃度離心第28頁,共126頁，星期六，2024年，5月蔗糖密度剃度離心第29頁,共126頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)研究技術(shù)平臺第30頁,共126頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)相關(guān)技術(shù)蛋白質(zhì)樣品的制備蛋白質(zhì)濃度的測定蛋白質(zhì)免疫印跡（westernblot)蛋白質(zhì)相互作用研究第31頁,共126頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)樣品制備單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?1)收集細(xì)胞（1*106以上）(2)加入適量含蛋白酶抑制劑的裂解液(3)冰上裂解(4)4℃下12000rpm離心5min,取上清，-20℃保存組織中總蛋白的提取(1)取組織塊（約0.1g)剪碎,加液氮磨碎、勻漿、超聲處理(2)4℃下12000rpm離心15min,取上清，-20℃保存(3)膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要超濾(4)組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性第32頁,共126頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)樣品制備試劑RIPA裂解配方：50mMTris-HClpH7.4、150mMNaCl、1mMPMSF、1mMEDTA、1%Tritonx-100、1%脫氧膽酸鈉、0.1%SDS蛋白酶抑制劑：1mMPMSF,Aprotinin1μg/ml,Leupeptin5μg/ml,pepestatin1μg/ml,AEBSF50μg/ml,Bestatin10μg/ml,E-641μg/mlPMSF儲存液：溶于異丙醇1.74mg/ml(10mmol/L)或17.4mg/ml(100mmol/L),分裝后保存于-20℃，使用時稀釋至1mmol/L，現(xiàn)用現(xiàn)加。第33頁,共126頁，星期六，2024年，5月各種細(xì)胞裂解液比較第34頁,共126頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)測定方法比較第35頁,共126頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)濃度測定Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度試劑G250考馬斯亮藍(lán)溶液：0.15mol/LNaCl：

1mg/ml牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)曲線

R2=0.999第36頁,共126頁，星期六，2024年，5月Bradford蛋白濃度測定試劑盒1.完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取10

l稀釋至100

l

，使終濃度為0.5mg/ml?？梢杂?.9%NaCl或PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。2.將標(biāo)準(zhǔn)品按0,1,2,4,8,12,16,20微升分別加到96孔板中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20微升。3.

加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液到20微升。4.

各孔加入200微升G250染色液，室溫放置3-5分鐘。5.

用酶標(biāo)儀測定A595，或560-610nm之間的其它波長的吸光度。6.

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中的蛋白濃度。第37頁,共126頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)核酸測定儀第38頁,共126頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)原理protein/id/protein/western-blot/第39頁,共126頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)免疫印跡（WB)過程Figure1.SDS第40頁,共126頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)免疫印跡（WB)過程Figure2.WesternBlot第41頁,共126頁，星期六，2024年，5月SDS所需儀器蛋白質(zhì)電泳儀第42頁,共126頁，星期六，2024年，5月SDS聚丙烯酰胺凝膠（SDS)的有效分離范圍第43頁,共126頁，星期六，2024年，5月配膠所需材料第44頁,共126頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印槽半干轉(zhuǎn)印槽浸漬轉(zhuǎn)印槽第45頁,共126頁，星期六，2024年，5月半干法轉(zhuǎn)移槽使用說明膜濾紙膠濾紙正極負(fù)極第46頁,共126頁，星期六，2024年，5月Westernblot所需材料還原型5×SDS上樣緩沖液

5×電泳液緩沖液浸漬式轉(zhuǎn)移緩沖液或半干式轉(zhuǎn)移緩沖液TBST或PBST緩沖液封閉液（抗體稀釋液）

洗脫抗體緩沖液化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯影液和定影液抗體Mark第47頁,共126頁，星期六，2024年，5月Westernblot操作流程配膠：根據(jù)蛋白質(zhì)分子量配制相應(yīng)濃度的SDS電泳：以5－100μg蛋白量上樣，電泳至溴酚蘭跑到底部。轉(zhuǎn)?。杭粝逻m當(dāng)大小的PVDF膜，把膠鋪在負(fù)極濾紙上，上面小心覆蓋泡好的PVDF膜，夾好后倒入電轉(zhuǎn)緩沖液，加入冰格，100V轉(zhuǎn)移1小時。封閉：膜加封閉液（5％脫脂牛奶inTBS-T）,室溫1h.抗體孵育：加一抗（1：1000）4℃孵育過夜，TBST洗三次，3x10min；加二抗（1：20000）室溫1h，TBS-T洗三次，3x10min；顯影：膜上加同體積ECLA，B液（100μl/cm2),依照熒光強(qiáng)度而定曝光時間，顯影1、5、15min,定影10min.保存：X-膠片干后，將分子量和加樣順序標(biāo)記上，把日期，抗體名稱，孵育時間寫上。把膜保存在－20℃以備以后使用。第48頁,共126頁，星期六，2024年，5月SDS常見問題第49頁,共126頁，星期六，2024年，5月Westernblot常見問題1、技術(shù)問題（1）電泳（2）轉(zhuǎn)膜2、抗體問題（特異性、濃度）3、蛋白質(zhì)豐度4、熒光淬滅（蛋白量過大）第50頁,共126頁，星期六，2024年，5月1、背景過深2、抗體特異性3、洗膜時間Westernblot常見問題第51頁,共126頁，星期六，2024年，5月Westernblot常見問題1、加樣量2、ECL試劑3、曝光時間第52頁,共126頁，星期六，2024年，5月Westernblot常見問題1、蛋白質(zhì)降解2、蛋白質(zhì)分子量內(nèi)參第53頁,共126頁，星期六，2024年，5月Westernblot常見問題4#：加樣量過多第54頁,共126頁，星期六，2024年，5月Westernblot常見問題

免疫組化和WesternBlot可以用同一種抗體嗎？

解答：免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會消失。如果抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區(qū)間。第55頁,共126頁，星期六，2024年，5月在做WesternBlot時，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？

解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加甲醇也是這個目的。Westernblot常見問題第56頁,共126頁，星期六，2024年，5月不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？

解答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度）(優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩沖液，可以參考《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》)，因為甲醇可降低蛋白質(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和PVDF膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯(lián)；低濃度膠，如低至6％。太大時還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉(zhuǎn)移電壓／電流；增加轉(zhuǎn)移時間。Westernblot常見問題第57頁,共126頁，星期六，2024年，5月蛋白分子量大小分別為21kd、28kd，用的是濕轉(zhuǎn)，請問多大電流，多長時間比較合適？

解答：分子量比較小，最好是用干轉(zhuǎn)，濕轉(zhuǎn)效率太高，易轉(zhuǎn)過了。干轉(zhuǎn)的話，用2.5A/cm2，30min就應(yīng)該夠了。濕轉(zhuǎn)，按照bio-rad的說明，用100mA，也得要半個多小時吧。Westernblot常見問題第58頁,共126頁，星期六，2024年，5月怎樣才能把膠跑的非常漂亮，泳道和band都能很直?

影響跑膠跑的質(zhì)量，有以下幾個因素：1、電壓，小的電壓會使膠的分子篩效應(yīng)得到充分發(fā)揮。電壓越小，條帶越漂亮，濃縮膠80v，分離膠100v就能跑得很好。2、膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。倒膠之前，一定要充分混勻，玻璃板一定要干凈，雙蒸水隔離時，一定要比較輕地加上去，避免稀釋下層的分離膠。Westernblot常見問題第59頁,共126頁，星期六，2024年，5月Westernblot結(jié)果如何分析目的蛋白110kd第60頁,共126頁，星期六，2024年，5月研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)平臺第61頁,共126頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖譜第62頁,共126頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)相互作用的重要意義２００種蛋白質(zhì)及２０００種組合結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析后，發(fā)現(xiàn)其中三分之一的蛋白質(zhì)相互組合會導(dǎo)致疾病，容易導(dǎo)致疾病的蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)結(jié)合以后也將變得十分活躍，致使發(fā)病和病情惡化絕大多數(shù)疾病都是由１０萬種以上的特定蛋白質(zhì)相互作用所致蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用和識別在諸如生物催化、轉(zhuǎn)運(yùn)、信號傳導(dǎo)、免疫、細(xì)胞調(diào)控等多種生命過程起著重要的作用。第63頁,共126頁，星期六，2024年，5月

可能參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的結(jié)構(gòu)域

第64頁,共126頁，星期六，2024年，5月一、酵母雙雜交系統(tǒng)

酵母激活因子GAL4：N端：147個氨基酸組成的DNA結(jié)合域(DNAbindingdomain,BD)，C端：113個氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活域(transcriptionactivationdomain,AD)。GAL4分子的DNA結(jié)合域可以和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結(jié)合，而轉(zhuǎn)錄激活域則能激活UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。

組成部分：（1）與BD融合的蛋白表達(dá)載體，被表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白（bait）；（2）與AD融合的蛋白表達(dá)載體，被其表達(dá)的蛋白稱靶蛋白（prey）；（3）帶由一個或多個報告基因的宿主菌株。

第65頁,共126頁，星期六，2024年，5月YeastTwoHybrid原理BDXCOOHADcDNANH2

COOH共轉(zhuǎn)化+BDX?ADGal4Gal4PromoterReporterTrp-Leu-cDNAlibraryNH2Gal4Gal4第66頁,共126頁，星期六，2024年，5月酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)采用高拷貝和強(qiáng)啟動子的表達(dá)載體使雜合蛋白過量表達(dá)，并且避免蛋白質(zhì)純化過程檢測在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，體現(xiàn)真核細(xì)胞內(nèi)真實情況可檢測存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時的相互作用可采用不同組織、器官、細(xì)胞類型和分化時期材料構(gòu)建cDNA文庫易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒具有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報道基因酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白結(jié)合第67頁,共126頁，星期六，2024年，5月酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用檢測已知蛋白質(zhì)之間的相互作用確定蛋白質(zhì)作用功能區(qū)域位點(diǎn)確定未知蛋白質(zhì)之間的相互作用確定基因治療中多肽類藥物的作用機(jī)理第68頁,共126頁，星期六，2024年，5月酵母雙雜交系統(tǒng)的局限性檢測定位于細(xì)胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)間相互作用“假陽性”：某些蛋白本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能融合蛋白會影響蛋白的真實結(jié)構(gòu)和功能“假陰性”：不利于核外蛋白研究第69頁,共126頁，星期六，2024年，5月酵母雙雜交的實驗流程

構(gòu)建誘餌質(zhì)粒（X-BD)

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌

檢測X-BD蛋白在酵母中的表達(dá)

通過酵母生長曲線檢測X-BD是否有毒性

進(jìn)行自激活測試第70頁,共126頁，星期六，2024年，5月

將文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化入X-BD-酵母篩選陽性克隆子（四缺，x-gal顯色反應(yīng)）共轉(zhuǎn)化再次確認(rèn)相互作用將陽性克隆子在二缺平板上劃線3次提取酵母質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli，提取質(zhì)粒

PCR或雙酶切去除含有相同長度cDNA的克隆子

DNA測序

NCBI數(shù)據(jù)庫搜索

第71頁,共126頁，星期六，2024年，5月酵母雙雜交基本過程第72頁,共126頁，星期六，2024年，5月舉例酵母雙雜交前準(zhǔn)備工作雙酶切驗證21kb5kb3.5kb2kb1.5kbM1

M:marker1:pGBKT7-BD-X構(gòu)建誘餌質(zhì)粒誘餌蛋白的表達(dá)X-BDGal4-BD檢測誘餌蛋白是否有毒性1

2

3Westernblot1.Yeast2.BD-yeast3.X-BD-yeast酵母生長曲線1.未轉(zhuǎn)化酵母2.BD-酵母3.X-BD-酵母第73頁,共126頁，星期六，2024年，5月酵母雙雜交結(jié)果X-BD+Y-ADGal4-BD+Gal4-ADGal4-BD+MPDIPO13+Gal4-ADSD/-Trp/-Leu-Trp/-Leu/-His/-Ade+3-AT（20mM）舉例SD/-Trp/-Leu-Trp/-Leu/-His/-Ade+3-AT（20mM）Gal4-BD+Gal4-ADGal4-BD+Y-ADX-BD+Gal4-AD第74頁,共126頁，星期六，2024年，5月

X-β-半乳糖苷酶藍(lán)白斑顯色分析舉例X-BD+Y-ADX-BD+gal4-ADGal4-BD+Y-ADgal4-BD+gal4-AD第75頁,共126頁，星期六，2024年，5月酵母雙雜交測序結(jié)果酵母雙雜交得到的陽性克隆子質(zhì)粒經(jīng)過DNA測序，由NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST檢索cDNA編碼的蛋白質(zhì)舉例第76頁,共126頁，星期六，2024年，5月測序結(jié)果查詢過程cDNA序列NCBIBLASTNucleotidemegablastsearchformatresults第77頁,共126頁，星期六，2024年，5月Blast舉例第78頁,共126頁，星期六，2024年，5月Results舉例第79頁,共126頁，星期六，2024年，5月酵母雙雜交系統(tǒng)的類型研究蛋白質(zhì)和DNA相互作用的實驗體系

單向酵母雙雜交系統(tǒng)第80頁,共126頁，星期六，2024年，5月酵母雙向雜交系統(tǒng)第81頁,共126頁，星期六，2024年，5月-His-Ura這個改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的選擇性培養(yǎng)基上只有當(dāng)“誘餌”和“獵物”相互作用激活URA3基因的表達(dá)才能生長。在含有5-FOA的完全培養(yǎng)基上“誘餌”和“獵物”的相互作用則抑制細(xì)胞的生長。反向雙雜交系統(tǒng)第82頁,共126頁，星期六，2024年，5月酵母三雜交系統(tǒng)a.第1、2個融合蛋白必須通過與成分3的結(jié)合，間接起到激活報道基因轉(zhuǎn)錄的作用，不能直接激活報告基因的轉(zhuǎn)錄；b.成分3具有分別與第1、2個融合蛋白結(jié)合的區(qū)域第83頁,共126頁，星期六，2024年，5月核外雙雜交技術(shù)

SosRecruitmentSysstem，SRS

36℃36℃membrane第84頁,共126頁，星期六，2024年，5月哺乳動物雙雜交系統(tǒng)X-半乳糖苷酶,螢火蟲和海腎熒光素酶第85頁,共126頁，星期六，2024年，5月研究蛋白質(zhì)相互作用的其他方法第86頁,共126頁，星期六，2024年，5月二、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)共定位綠色熒光羅丹明染色重疊相差第87頁,共126頁，星期六，2024年，5月三、谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶沉淀試驗

(GST-pulldown）原理GSTXY谷胱甘肽-瓊脂糖球珠細(xì)胞裂解物

tube4℃下孵育2h

GST融合蛋白GSTXY+第88頁,共126頁，星期六，2024年，5月GSTpulldown實驗流程（1）Glutathione瓊脂糖珠預(yù)處理。（2）GST融合蛋白掛柱：取適量GST-融合蛋白與10μl已經(jīng)處理過的beads置于1.5ml離心管中，4℃,搖床孵育過夜。（3）孵育過夜的蛋白質(zhì)與beads的混合液于4℃,500g離心5min，上清收集，觀察融合蛋白是否飽和地掛在beads上，用1ml冰冷的細(xì)胞裂解緩沖液洗三次beads。（4）把轉(zhuǎn)染目的基因的細(xì)胞（5×106）裂解在0.5ml細(xì)胞裂解液里（含蛋白酶抑制劑），最大轉(zhuǎn)速4℃離心20min,收集上清液。（5）將細(xì)胞裂解液上清加入beads中，混勻，4℃，搖床3h。（6）3h后，用冰冷的細(xì)胞裂解緩沖液洗三次。（7）加15μl2×SDS上樣緩沖液，煮沸5min.（8）SDS,WesternBlot或質(zhì)譜儀分析。（9）對照（GST）同樣處理。第89頁,共126頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)電泳儀第90頁,共126頁，星期六，2024年，5月GSTpulldown驗證兩種已知蛋白質(zhì)的相互作用舉例inputGSTY-GFP+++X-GSTY-GFPX-GFP+++GSTinput105kDAnti-GFPAnti-GFPY-GSTX-GFP第91頁,共126頁，星期六，2024年，5月五、免疫共沉淀原理/Proteomics第92頁,共126頁，星期六，2024年，5月免疫共沉淀實驗流程（1）轉(zhuǎn)染后24-48h可收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min,細(xì)胞裂解液于4°C，最大轉(zhuǎn)速離心30min后取上清。（2）取少量裂解液以備Westernblot分析，剩余裂解液加1μg相應(yīng)的抗體加入到細(xì)胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜。（3）取10μlproteinA瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3次，每次3,000rpm離心3min。（4）將預(yù)處理過的10μlproteinA瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細(xì)胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與proteinA瓊脂糖珠偶連。（5）免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C以3,000rpm速度離心3min，將瓊脂糖珠離心至管底。將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3－4次。最后加入15μl的2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5分鐘。（6）SDS,Westernblotting或質(zhì)譜儀分析.第93頁,共126頁，星期六，2024年，5月免疫共沉淀驗證兩種已知蛋白質(zhì)的相互作用Y-GFPY-GFPGFPY-GFP+X-HAIP:HAcontrolIgGIP:HAGFPAnti-GFPAnti-GFPAnti-GFPAnti-HAAnti-HAAnti-HAY-GFPX-HAinputinput舉例第94頁,共126頁，星期六，2024年，5月如何尋找未知的相互作用蛋白質(zhì)？？？第95頁,共126頁，星期六，2024年，5月

四、質(zhì)譜儀分析相互作用蛋白質(zhì)第96頁,共126頁，星期六，2024年，5月電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）生物質(zhì)譜儀：主要用以進(jìn)行生物大分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)分析。以八十年代后期出現(xiàn)的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀和電噴霧四極質(zhì)譜儀為代表?？蓪Ψ肿恿扛哌_(dá)幾十萬的生物大分子進(jìn)行快速（幾分鐘一個樣品）、精確（0.01%）和高靈敏度（10-15mol）的測定。第97頁,共126頁，星期六，2024年，5月質(zhì)譜分析流程蛋白質(zhì)信息數(shù)據(jù)庫檢索第98頁,共126頁，星期六，2024年，5月五、免疫沉淀與質(zhì)譜儀分析蛋白質(zhì)相互作用第99頁,共126頁，星期六，2024年，5月

六、質(zhì)譜儀分析蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖第100頁,共126頁，星期六，2024年，5月第101頁,共126頁，星期六，2024年，5月一.概述蛋白質(zhì)組及蛋白質(zhì)組概念的提出蛋白質(zhì)組學(xué)形成的歷史蛋白質(zhì)組研究的主要手段第102頁,共126頁，星期六，2024年，5月人類基因組計劃的完成3-4萬個基因，30億對堿基（解碼生命）基因組是唯一的，但蛋白表達(dá)是變化的（解碼生命）后基因組—蛋白質(zhì)組的研究是21世紀(jì)生命科學(xué)的主要任務(wù)（WilkinsMRetal1997)1994年Williams提出測定有機(jī)體的基因組所表達(dá)的全部蛋白1995年Wilkins正式提出Proteome一詞由一個細(xì)胞或一個組織的基因組所表達(dá)的全部相應(yīng)的蛋白質(zhì)，而研究蛋白質(zhì)組功能為蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）1、蛋白質(zhì)組及蛋白質(zhì)組概念的提出第103頁,共126頁，星期六，2024年，5月基因組轉(zhuǎn)錄組蛋白組ThestudyofproteinsexpressedbygenomesCompletionofthesequencingofthe1stdraftofhumangenomeindicatesthereareapproximately250,000proteinsinthehumangenomeOnly2-5%ofproteinsinhumangenomehavebeenidentified第104頁,共126頁，星期六，2024年，5月第105頁,共126頁，星期六，2024年，5月第106頁,共126頁，星期六，2024年，5月Expressionproteomics(表達(dá)蛋白組學(xué))ThestudyofglobalchangesinproteinexpressionProteomicsCell-mapproteomics（細(xì)胞圖譜蛋白組學(xué)）Thesystematicstudyofprotein-proteininteractionsthroughtheisolationofproteincomplexes第107頁,共126頁，星期六，2024年，5月2、蛋白質(zhì)組學(xué)形成的歷史1860FriedrichMiescheridentifiedacidandbasicproteincomponentsincellnucleiwhichwasmistakenlybelievedtocarrythegeneticmaterial

1970KenrickandMargolisIsoelectricfocusingandgradientgelelectrophoresis:atwo-dimensionaltechnique

1972BernsteinetalTheProteinDataBankwithacollectionoftenX-raycrystallographicproteinstructures

1975O'FarrellThemodernformoftwo-dimensionalelectrophoresisofproteinsbyhighresolutionseparation第108頁,共126頁，星期六，2024年，5月1995WilkinsDefinitionoftheproteome

1997WilkinsetalPublicationofthefirstbookonproteomics

1999IanHumphery-Smith.ThefirstChairinProteomicscreatedattheUniversiteitUtrecht,TheNetherlands.Occupant

2000MarchPublicationofthemostcompleteproteomeofawholeorganism,thebacteriumMycoplasma

genitalium

2001S