高中生物【分層作業(yè)】3.1 第3課時 目的基因的獲取DNA的粗提取和鑒定基因表達載體的構(gòu)建（蘇教2019版選擇性必修3）

第3章基因工程第1節(jié)基因工程及其技術(shù)第3課時目的基因的獲取、DNA的粗提取和鑒定、基因表達載體的構(gòu)建必備知識基礎練1.在已知某小片段基因堿基序列的情況下，獲得該基因的最佳方法是()A.逆轉(zhuǎn)錄合成cDNAB.用化學合成法合成C.利用PCR技術(shù)擴增D.從基因文庫中提取2.下列有關(guān)目的基因獲取的理解，不正確的是()A.目的基因可以從自然界中分離，也可以人工合成B.cDNA文庫的構(gòu)建需要用到逆轉(zhuǎn)錄酶C.基因文庫就是基因組文庫D.cDNA文庫只含有某種生物的一部分基因3.下列有關(guān)基因表達載體的敘述，不正確的是()A.具有復制原點，使目的基因能在受體細胞內(nèi)擴增B.具有啟動子，作為核糖體識別、結(jié)合的部位C.具有標記基因，有利于重組DNA的鑒定和選擇D.具有目的基因，以獲得特定的基因表達產(chǎn)物4.為了在大腸桿菌細胞中成功表達人胰島素基因，首先需要提取細胞的mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄等過程來獲取目的基因。下列相關(guān)敘述錯誤的是()A.用于逆轉(zhuǎn)錄的mRNA只能從胰島B細胞中獲取B.逆轉(zhuǎn)錄過程需要四種游離的核糖核苷酸作為原料C.經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到的目的基因不含啟動子和內(nèi)含子D.逆轉(zhuǎn)錄獲取目的基因時，遵循堿基互補配對原則5.圖中pUC18是一種常用質(zhì)粒，其中ori為復制原點，Ap為青霉素抗性基因，lacZ基因能合成某種酶，該酶能將無色染料X-gal變成藍色。已知目的基因插入的位置如圖所示。為了快速篩選出獲得目的基因的大腸桿菌，平板培養(yǎng)基內(nèi)除了要有大腸桿菌生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)和瓊脂，還必須加入其他物質(zhì)。下列敘述正確的是()A.只需要加入青霉素B.lacZ基因是目的基因C.含有目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌不能將X-gal變成藍色D.ori可以啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄6.[2022江蘇揚州邗江中學高二期中改編]用雞血進行DNA的粗提取與鑒定。下列有關(guān)敘述不正確的是()A.將雞血靜置后取上清液進行實驗B.DNA在2mol·L-1的NaCl溶液中溶解度最大C.可用冰乙醇進行DNA的純化D.在沸水浴條件下，DNA與二苯胺試劑反應呈藍色7.[2023江蘇鹽城伍佑中學高二調(diào)研]下列關(guān)于DNA的粗提取與鑒定實驗的各步驟操作的目的的表述，錯誤的是()A.沉淀的血細胞中加水是為了使血細胞破裂從而提取DNAB.加入物質(zhì)的量濃度為2mol·L-1的NaCl溶液是為了溶解DNAC.向溶解有DNA的NaCl溶液中加蒸餾水是為了洗滌DNA，除去雜質(zhì)D.在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍色8.在DNA的粗提取實驗中，將核內(nèi)DNA溶解于2mol·L-1的NaCl溶液中后，緩緩加入蒸餾水直到絮狀物不再增加，此時若繼續(xù)加蒸餾水，看到的現(xiàn)象是()A.絮狀物量不變B.絮狀物量增加C.絮狀物量減少D.絮狀物量先增加后減少9.下圖表示以雞血為實驗材料進行DNA的粗提取與鑒定的操作程序。請分析并回答下列問題：(1)步驟一中向雞血細胞液中加入并攪拌，可使雞血細胞破裂。

(2)步驟二中過濾后，收集含有DNA的。

(3)步驟三、四的操作原理是DNA在中溶解度不同而去除雜質(zhì)。步驟四的主要操作是滴加蒸餾水并攪拌，當觀察到溶液中時，操作停止，過濾去除溶液中的雜質(zhì)。

(4)氯仿密度大于水，能使蛋白質(zhì)變性沉淀，與水和DNA均不相溶，且對DNA影響極小。為了進一步提高DNA純度，依據(jù)氯仿的特性，步驟七的具體操作是將步驟六獲得的濾液與等量的氯仿充分混合，靜置一段時間，吸取，然后加入等體積的，至燒杯中會出現(xiàn)白色絮狀物，這就是粗提取的DNA。

關(guān)鍵能力提升練10.[2023江蘇宿遷泗洪中學高三月考]下圖為基因表達載體的模式圖。下列敘述錯誤的是()A.構(gòu)建基因的表達載體需要用到限制酶和DNA連接酶B.終止子位于基因的下游，使翻譯在所需要的地方停止下來C.構(gòu)建成功后可使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并遺傳給下一代D.抗生素抗性基因作為標記基因，可檢測受體細胞中是否導入了目的基因11.[多選]下圖是基因文庫的構(gòu)建和獲取目的基因的示意圖。下列敘述不正確的是()A.通過該途徑能獲得該生物的全部基因B.①過程通常只用一種DNA酶切割全部DNAC.②過程需要DNA連接酶的作用D.④過程可用相應抗體，利用核酸分子雜交技術(shù)獲取目的基因12.某研究組對DNA粗提取的步驟進行了創(chuàng)新：利用液氮快速粉碎植物樣品，采用堿裂解(0.5mol·L-1NaOH使細胞破碎)的方式提取DNA，提取的DNA利用TE緩沖液中和，得到DNA粗提溶液。下列說法錯誤的是()A.可采用洋蔥或雞血細胞為材料提取DNAB.利用液氮處理樣品的作用是使植物細胞彼此分離C.堿溶液可能可以破壞細胞質(zhì)膜和細胞壁D.TE緩沖液中析出的DNA應溶解在2mol·L-1的NaCl溶液中13.[多選]提取生物大分子的基本思路是選用一定的物理或化學方法分離具有不同物理或化學性質(zhì)的生物大分子，如提取DNA就要利用它與RNA、蛋白質(zhì)等在物理和化學性質(zhì)方面的差異來去除其他成分。下列有關(guān)DNA的粗提取與鑒定的敘述，錯誤的是()A.可用新鮮豬血代替雞血做實驗材料B.為避免顏色干擾，實驗中不能采用菠菜葉片作為實驗材料C.收集、保存好剩余的二苯胺試劑，以備以后實驗時繼續(xù)使用D.純化提取的DNA時，要控制NaCl溶液濃度反復溶解和析出DNA14.下圖是“DNA的粗提取和鑒定”實驗中幾個重要的操作示意圖。下列敘述錯誤的是()A.圖①的原理是DNA不溶于冰乙醇，而某些蛋白質(zhì)可溶于冰乙醇B.圖①和圖③都需要用玻璃棒沿一個方向輕輕攪拌，便于DNA的析出并保持結(jié)構(gòu)完整C.若圖③操作后接圖②操作，則DNA會留在濾液中D.若圖④操作后接圖②操作，則DNA會留在紗布上15.[2022江蘇泰州中學高二期中]葉綠體DNA(cpDNA)大多為環(huán)狀雙鏈，其基因組序列高度保守，目前已在分子標記、核質(zhì)互作、葉綠體基因工程等方面開展了廣泛研究。下列為提取cpDNA的相關(guān)步驟，其中SDS能瓦解生物膜，苯酚使蛋白質(zhì)變性析出，氯仿與苯酚互溶，易于除去苯酚。(1)葉綠體的分離①勻漿使細胞破碎：將葉片于4℃冰箱黑暗饑餓處理12~24h后，剪成1cm長度，放入勻漿機，倒入緩沖液，先低速勻漿2次，再高速勻漿3次，每次5~10s。勻漿前黑暗饑餓處理的目的是，有利于cpDNA的提取。

②離心得到葉綠體的粗提物：將勻漿液過濾后離心，棄沉淀以去除細胞殘??；將得到的上清液再次離心，棄上清液，即得葉綠體的粗提物，第二次離心的速度比第一次的。整個過程中線粒體分布在中，從而避免了線粒體DNA對cpDNA的污染。

(2)去除核DNA：向葉綠體的粗提物中加入、緩沖液，37℃靜置15min后，離心取，從而去除吸附在葉綠體外膜上的核DNA。

(3)葉綠體的裂解和cpDNA的粗提：將純化的葉綠體加入緩沖液、SDS、蛋白酶K，55℃水浴3h，使葉綠體裂解，釋放出cpDNA，離心取上清液。在上清液中加入苯酚和氯仿，離心后的液體包括上層水相、中層變性蛋白和下層有機溶劑，cpDNA分布于中，小心用吸取該層液體。

(4)沉淀cpDNA：向粗提溶液中加入3mol·L-1的醋酸鈉及，離心取沉淀物。

(5)電泳檢測cpDNA：下圖中1、2是某品種茶樹用上述方法提取到的cpDNA的凝膠電泳結(jié)果，其中M是已知大小的不同DNA的混合物。組2無條帶，表明提取不成功，其可能的原因之一是操作過程中葉綠體裂解時間過長，使。

16.科研人員利用大腸桿菌構(gòu)建了抗蟲基因文庫。最新研究發(fā)現(xiàn)，漏斗蜘蛛中的AH基因控制合成的毒素肽具有顯著的殺蟲效果，現(xiàn)以p-B質(zhì)粒為載體，構(gòu)建AH基因的cDNA文庫。圖1表示p-B質(zhì)粒，其中Cmlr表示氯霉素抗性基因，ccdB基因表達產(chǎn)物能抑制大腸桿菌DNA的復制，圖中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點，且不同種的限制酶的識別序列不同，其中AiuⅠ、XbaⅠ、SspⅠ和MfeⅠ識別的堿基序列和酶切位點分別是↓—AGCT—、↓—TCTAGA—、↓—AATATT—、↓—CAATTG—。請分析并回答下列問題：(1)為獲得AH基因的cDNA，先要從漏斗蜘蛛的毒素肽分泌細胞中提取，再通過合成出AH基因的cDNA。若從漏斗蜘蛛其他組織細胞提取，則難以成功，原因是。

(2)若已知AH基因的cDNA兩端部分序列為5'AACTATGCGC……CGTAGCCTCT3'，請寫出PCR擴增該cDNA時的兩個引物對應的局部序列(前10個堿基序列)，并標明5'端和3'端：、。一個初始雙鏈cDNA經(jīng)四輪循環(huán)后，共消耗這兩種引物的數(shù)量為個。

(3)利用圖中的質(zhì)粒和AH基因構(gòu)建重組質(zhì)粒時，宜選用限制酶雙酶切割質(zhì)粒，再選用限制酶切割目的基因，將切割后獲得的DNA片段混合，經(jīng)處理后，再與大腸桿菌混合培養(yǎng)。

學科素養(yǎng)創(chuàng)新練17.生物興趣小組以蘋果為材料開展細胞中DNA的含量測定研究，主要實驗流程如下圖，其中SDS(十二烷基硫酸鈉)具有破壞細胞質(zhì)膜和核膜、使蛋白質(zhì)變性等作用，苯酚和氯仿不溶或微溶于水。它們的密度均大于水。請分析并回答下列問題：(1)步驟①中蘋果組織研磨前先經(jīng)液氮冷凍處理的主要優(yōu)點是。

(2)根據(jù)實驗流程可推知，步驟③④所依據(jù)的原理是。

(3)步驟⑤加入2~3倍冰乙醇的目的是。

(4)下面是某同學設計的DNA鑒定實驗的主要步驟：①取1支20mL試管，向其中先后加入物質(zhì)的量濃度為2mol·L-1的NaCl溶液5mL和少量絮狀DNA沉淀，用玻璃棒攪拌使其溶解；②向試管中加入4mL二苯胺試劑，混勻后將試管置于50~60℃水浴中加熱5min，待試管冷卻后，觀察溶液是否變藍。請指出上面實驗步驟中的兩個錯誤：、。

(5)該興趣小組成員還以同種蘋果的不同組織器官為材料，測定不同組織細胞中DNA的含量，結(jié)果如下表(表中數(shù)值為每克生物材料干重中DNA的含量)。組織器官韌皮部形成層冬芽秋梢嫩葉成熟葉片含量/(μg·g-1)80.00150.00160.00120.0070.00試從細胞分裂的角度，解釋不同生物材料中DNA的含量差異明顯的原因：。

第3課時目的基因的獲取、DNA的粗提取和鑒定、基因表達載體的構(gòu)建參考答案1.【答案】B【解析】基因工程中獲取目的基因的方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增、化學合成法等，對于比較小且核苷酸序列已知的目的基因來說，可以通過DNA合成儀用化學合成法直接人工合成，B項符合題意。2.【答案】C【解析】目的基因可以用限制酶從自然界中分離，也可以通過人工合成的方法獲取，A項正確；cDNA文庫的構(gòu)建需要用到逆轉(zhuǎn)錄酶，以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化形成cDNA，B項正確；基因文庫包括基因組文庫和部分基因文庫，C項錯誤；cDNA文庫是部分基因文庫中的一種，只包含一種生物的部分基因，D項正確。3.【答案】B【解析】基因表達載體具有啟動子，是RNA聚合酶識別、結(jié)合的部位，B項錯誤。4.【答案】B【解析】胰島素基因只在胰島B細胞中表達，因此只能從胰島B細胞中獲取用于逆轉(zhuǎn)錄的mRNA，A項正確；逆轉(zhuǎn)錄過程是以RNA為模板合成DNA的過程，以四種游離的脫氧核糖核苷酸為原料，B項錯誤；真核細胞的mRNA轉(zhuǎn)錄后通過加工剪切了內(nèi)含子和啟動子，因此逆轉(zhuǎn)錄得到的基因不含啟動子和內(nèi)含子，C項正確；逆轉(zhuǎn)錄獲取目的基因利用堿基互補配對原則獲得DNA鏈，D項正確。5.【答案】C【解析】該培養(yǎng)基中應加入青霉素和無色染料X-gal，A項錯誤；lacZ基因的作用為標記基因，B項錯誤；重組質(zhì)粒中插入目的基因破壞了lacZ基因，含這種重組質(zhì)粒的大腸桿菌，不能合成該酶，故無法將無色染料X-gal變成藍色，C項正確；啟動子在基因的首段，它是RNA聚合酶的結(jié)合位點，能控制轉(zhuǎn)錄的開始，只有啟動子才能驅(qū)動目的基因的轉(zhuǎn)錄，D項錯誤。6.【答案】A【解析】在新鮮雞血中加入適量的檸檬酸鈉防止血液凝固，混合均勻后置于4℃冰箱內(nèi)，靜置1天，取血細胞的沉淀物進行實驗，A項錯誤。7.【答案】C【解析】沉淀的血細胞中加水是為了使血細胞破裂釋放DNA，從而提取DNA，A項正確；NaCl溶液的物質(zhì)的量濃度為2mol·L-1時，DNA溶解，B項正確；向溶解DNA的燒杯中加蒸餾水是為了降低NaCl溶液的濃度，從而使DNA析出，C項錯誤；在一定溫度(沸水浴)下，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍色，D項正確。8.【答案】C【解析】DNA在2mol·L-1的NaCl溶液中溶解，緩緩加入蒸餾水使得NaCl溶液濃度降低，則DNA的溶解度降低，DNA不斷析出；DNA絮狀物量不再增加時，此時DNA的溶解度最低，如繼續(xù)加蒸餾水，DNA的溶解度增加，DNA絮狀物量減少，C項符合題意。9.【答案】(1)蒸餾水(2)濾液(3)不同濃度的NaCl溶液(4)絮狀物不再增加上清液冰乙醇【解析】(1)分析流程圖可知，進行DNA的粗提取與鑒定時，步驟一中向雞血細胞液中加入蒸餾水并攪拌，可使雞血細胞破裂。(2)步驟二中過濾后，可除去細胞質(zhì)膜碎片等不溶物，收集含有DNA的濾液。(3)步驟三、四的操作原理是DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同而去除雜質(zhì)。步驟四的主要操作是滴加蒸餾水并攪拌，當觀察到溶液中絮狀物(主要成分是DNA)不再增加時，操作停止，過濾去除溶液中的雜質(zhì)。(4)氯仿密度大于水，能使蛋白質(zhì)變性沉淀，與水和DNA均不相溶，且對DNA影響極小。為了進一步提高DNA純度，依據(jù)氯仿的特性，步驟七的具體操作是將步驟六獲得的濾液與等量的氯仿充分混合，靜置一段時間，吸取上清液，然后加入等體積的冰乙醇，至燒杯中會出現(xiàn)白色絮狀物，這就是粗提取的DNA。10.【答案】B【解析】終止子位于基因的下游，其作用是使轉(zhuǎn)錄在相應的地方停止，不是使翻譯在所需要的地方停止下來，B項錯誤。11.【答案】BD【解析】該過程為基因組文庫的構(gòu)建過程，基因組文庫包含該生物的所有基因，A項正確；①過程使用限制酶，其識別并切割DNA分子上特定的核苷酸序列，B項錯誤；②過程需要DNA連接酶的作用，C項正確；④過程可用特定的基因探針，利用核酸分子雜交技術(shù)獲取目的基因，D項錯誤。12.【答案】D【解析】洋蔥或雞血細胞均有細胞核，核中有DNA，所以可以用二者為材料提取DNA，A項正確；由題干“液氮快速粉碎植物樣品”可知，利用液氮處理樣品的作用是使植物細胞彼此分離，B項正確；由題干“NaOH使細胞破碎”可知，NaOH呈堿性，堿溶液可能可以破壞細胞質(zhì)膜和細胞壁，C項正確；由題干可知，TE緩沖液就是溶解DNA的溶液，D項錯誤。13.【答案】ABC【解析】豬屬于哺乳動物，哺乳動物成熟的紅細胞沒有細胞核，因此新鮮豬血不能作為該實驗的實驗材料，A項錯誤；加入酒精溶解色素后過濾，DNA粗提取后不含葉綠素，用菠菜葉做實驗不影響實驗效果，B項錯誤；二苯胺試劑需要現(xiàn)配現(xiàn)用，C項錯誤；純化DNA時，要控制NaCl溶液濃度過濾除去其中的雜質(zhì)，最后用2mol·L-1的NaCl溶液溶解DNA，D項正確。14.【答案】B【解析】圖①的原理是DNA不溶于冰乙醇，某些蛋白質(zhì)可溶于冰乙醇，以便除去溶于冰乙醇的雜質(zhì)，提取含雜質(zhì)較少(或較純凈)的DNA，A項正確；圖①中玻璃棒逆時針方向攪拌，目的是提取出含雜質(zhì)較少的DNA，圖③中玻璃棒順時針方向攪拌，目的是加速細胞吸水破裂，B項錯誤；圖③操作是加入蒸餾水，破碎細胞，圖②操作是過濾，獲取含DNA的濾液，使DNA留在濾液中，C項正確；圖④操作是去除濾液中的雜質(zhì)，析出DNA，圖②操作是過濾，將DNA留在紗布上，D項正確。15.【答案】(1)①使葉綠體中的淀粉消耗掉②快上清液(2)DNA酶沉淀(3)上層水相移液槍(微量移液器)(4)冰乙醇(5)cpDNA片段斷裂或降解，所提取的cpDNA含量少【解析】(1)①勻漿使細胞破碎：將葉片于4℃冰箱黑暗饑餓處理12~24h后，剪成1cm長度，放入勻漿機，倒入緩沖液，先低速勻漿2次，再高速勻漿3次，每次5~10s。勻漿前黑暗饑餓處理的目的是使葉綠體中的淀粉消耗掉，有利于cpDNA的提取。②離心得到葉綠體的粗提物：將勻漿液過濾后離心，棄沉淀以去除細胞殘?。粚⒌玫降纳锨逡涸俅坞x心，棄上清液，即得葉綠體的粗提物，第二次離心的速度比第一次的快。整個過程中線粒體分布在上清液中，從而避免了線粒體DNA對cpDNA的污染。(2)向葉綠體的粗提物中加入DNA酶可水解DNA，37℃靜置15min后，離心取沉淀，從而去除吸附在葉綠體外膜上的核DNA。(3)由于DNA可以溶解在水里，所以在上清液中加入苯酚和氯仿，離心后的液體包括上層水相、中層變性蛋白和下層有機溶劑，cpDNA分布于上層水相中，小心用移液槍吸取該層液體。(4)DNA不溶于冰乙醇，向粗提溶液中加入3mol·L-1的醋酸鈉及冰乙醇，使DNA沉淀，所以離心取沉淀物獲取cpDNA。(5)組2無條帶，表明提取不成功，其可能的原因之一是操作過程中葉綠體裂解時間過長，使cpDNA片段斷裂或降解，所提取的cpDNA含量少。16.【答案】(1)mRNA逆轉(zhuǎn)錄AH基因在其他組織細胞中不表達，提取不到AH基因的mRNA(2)5'AACTATGCGC3'5'AGAGGCTACG3'30(3)AiuⅠ和MfeⅠSspⅠ和MfeⅠDNA連接酶【解析】(1)AH基因的cDNA可以通過逆轉(zhuǎn)錄獲得，因此需要先從漏斗蜘蛛的毒素肽分泌細胞中提取mRNA，再逆轉(zhuǎn)錄合成AH基因的cDNA。由于AH基因在其他組織細胞中是不表達的，因此若從漏斗蜘蛛其他組織細胞提取，則難以成功。(2)根據(jù)題意分析，已知AH基因的cDNA兩端部分序列為5'AACTATGCGC……CGTAGCCTCT3'，則其在利用PCR技術(shù)進行擴增時，需要兩種不同的引物，且引物與目的基因(雙鏈)兩側(cè)的堿基序列是互補的，因此兩個引物對應的局部序列(前10個堿基序列)為5'AACTATGCGC3'、5'AG