MMP-2在早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變新生小鼠模型中的表達-0

1/1MMP-2在早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變新生小鼠模型中的表達MMP-2在早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變新生小鼠模型中的表達【摘要】目的檢測MMP-2在新生小鼠模型中的表達，探討MMP-2在早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變發(fā)病過程中的作用。

方法將7日齡C57BL/6J小鼠置于75%2%高氧環(huán)境中，5天后再置于正?？諝猸h(huán)境中，建立高氧誘導(dǎo)的早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的小鼠模型。

于鼠齡17天時處死動物并摘除眼球，應(yīng)用免疫組化方法檢測視網(wǎng)膜組織中MMP-2的表達情況。

結(jié)果MMP-2在對照組和高氧組的積分光密度值分別為16.334.13和21.126.29，兩者比較有顯著性差異(t=3.160，Plt;0.01)。

結(jié)論MMP-2可能對早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的新生血管生成有一定作用。

【關(guān)鍵詞】早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變;MMP-2;視網(wǎng)膜新生血管Abstract:ObjectiveThisresearchusingOxygenInducedRetinopathymodelexaminestheexpressionsofMMP-2andinquiresitscontributionintoretinopathypathologyofprematurebabies.Methods7-daynewbornC57BL/6Jratswereraisedinstandardizedincubatorandexposedto(752)%oxygenconcentrationfor5days,thenreturnedtonormalair,inordertoestablisharatmodelofretinopathypathologyofprematurebabies.Ratswerekilledonthe17thdayoflife.Retinasweredissectedandstainedbyimmunohistochemicalmethod.ResultsIODofMMP-2wassignificantlyincreased21.126.29intheROPgroup,and16.334.13inthecontrolgroup.Therewassignificantdifference(t=3.160，Plt;0.01)inthelevelofMMP-2betweenROPgroupandcontrolgroup.ConclusionsItsuggeststhattheexistenceofMMP-2inaratmodeldoexertsomeeffectonthegenerationofretinalneovascularizationofprematurebabiesretinopathypathology.Keywords:retinopathypathologyofprematurebabies;MMP-2;retinalneovascularization早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(Retinopathyofprematurity，ROP)是發(fā)生于早產(chǎn)和低體重兒的一種致盲性視網(wǎng)膜病變，其病理特征為視網(wǎng)膜血管異常增生，嚴重者可引起玻璃體出血、視網(wǎng)膜變性、視網(wǎng)膜脫離等多種并發(fā)癥。

上世紀80年代以來，由于醫(yī)療技術(shù)的快速發(fā)展，早產(chǎn)兒的成活率也顯著提高，ROP的發(fā)病率也隨之呈上升趨勢，在體重低于1000g的超低體重兒，發(fā)病率高達80%以上[1,2]。

目前，ROP已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)兒童致盲的重要原因，約占兒童致盲原因的6%～18%[3]。

防治ROP以改善早產(chǎn)兒的生存質(zhì)量己成為全球關(guān)注的焦點。

己經(jīng)明確ROP與吸氧治療高度相關(guān)，早產(chǎn)、高氧和低出生體重是發(fā)病過程中最為關(guān)鍵的因素，但其發(fā)病的確切機制至今仍不明確。

研究表明，視網(wǎng)膜新生血管形成在ROP的發(fā)病機制中起主導(dǎo)作用。

盡管近年來人們對視網(wǎng)膜新生血管的認識研究有了不少突破，但由于其確切發(fā)病機制仍然不明，目前臨床上尚無完全根治性手段。

在對視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生機制的研究中，諸多生長因子、細胞因子和炎癥介質(zhì)發(fā)揮的作用一直是關(guān)注的重點。

近些年來，對基質(zhì)金屬蛋白酶的研究成為熱點。

本研究在早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的小鼠模型中，應(yīng)用免疫組化方法，檢測了基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)的表達，進一步探討MMP-2在早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變發(fā)病過程中的作用。

1材料和方法1.1實驗動物中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物實驗中心提供的健康的清潔級C57BL/6J幼鼠(與哺乳母鼠在一起)，選擇鼠齡7天的共40只，雌雄兼有。

1.2實驗試劑MMP-2免疫組化試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變小鼠模型的建立選擇鼠齡7天的健康清潔級C57BL/6J幼鼠40只，與哺乳母鼠在一起，雌雄兼有，隨機分成2組，高氧組20只，對照組20只。

對照組在正常環(huán)境溫度下飼養(yǎng);高氧組置于密閉有機玻璃容器內(nèi)。

容器內(nèi)接入100%濕潤醫(yī)用純氧氣，使容器內(nèi)氧分壓保持在75%2%，并用測氧儀全程監(jiān)測容器內(nèi)的氧分壓，確保氧濃度的恒定。

高氧環(huán)境下飼養(yǎng)5天，然后移置正常環(huán)境溫度中飼養(yǎng)。

每天日光照明12小時，環(huán)境溫度控制在(232)℃。

每日打開氧箱更換墊料、加食、替換母鼠1次。

1.4標本的制備鼠齡17天時處死幼鼠，將眼球摘除，浸泡于4%多聚甲醛中性緩沖液中固定24小時，保存溫度為4℃。

梯度酒精脫水、二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋。

標記方向，制作切片時應(yīng)避開視乳頭周圍，含有視神經(jīng)的切片應(yīng)排除在外。

連續(xù)切片，厚度6m，切片方向平行于角膜至視乳頭的矢狀位平面。

1.5免疫組化法按照即用型SABC免疫組化試劑盒使用說明書進行操作：

石蠟切片置于60℃烘箱2～3小時溶解石蠟，二甲苯常規(guī)脫蠟至水，0.3%過氧化氫室溫孵育5～10分鐘，切片置于抗原修復(fù)液中92～98℃水浴10min，室溫中冷卻20min。

滴加5%BSA封閉液，滴加適當(dāng)稀釋的一抗(1：

150)，4℃過夜。

次日滴加生物素標記的二抗工作液，置濕盒內(nèi)37℃，滴加試劑SABC，室溫孵育30min。

DAB顯色：

使用DAB顯色劑試劑盒，取蒸餾水1mL，加試劑盒中A、B、C試劑各一滴，混勻后加至切片，室溫避光10min。

蘇木素復(fù)染1min，脫水、透明、封片、鏡下觀察。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)標準差表示，所有數(shù)據(jù)均以統(tǒng)計分析軟件SPSS11.5forwindows進行分析，采用獨立樣本t檢驗方法，以Plt;0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的標準。

2結(jié)果2.1MMP-2在視網(wǎng)膜的表達MMP-2以背景清晰細胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，主要位于視網(wǎng)膜內(nèi)界膜附近，神經(jīng)節(jié)細胞層，內(nèi)核層。

2.2免疫組化的半定量檢測每張切片在高倍顯微鏡下隨機選擇10個視野，采用Metamorph/DP10/BXS1圖像分析軟件，測量其積分光密度值(IOD值)，MMP-2在對照組和高氧組的積分光密度值(IOD值)分別為16.334.13和21.126.29，兩者比較有顯著性差異(t=3.160，Plt;0.01)。

3討論研究認為早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的主要病理改變?yōu)橐暰W(wǎng)膜新生血管生成，而視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生過程是從預(yù)先存在的血管形成新的毛細血管，因此在其最初階段必須使血管內(nèi)皮細胞趨化、遷移通過基底膜，而這一過程必須通過基質(zhì)金屬蛋白酶消化血管內(nèi)皮細胞層下面的細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)屏障[4]。

基質(zhì)金屬蛋白酶是一類活性依賴鋅離子和鈣離子的可以降解細胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，包括約20種酶，主要分為膠原酶類(MMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-18)，明膠酶類(MMP-2、MMP-9)，基質(zhì)水解酶類(MMP-3、MMP-10、MMP-11)，膜型酶類(MT-MMP)等，它們的分子量從20～100kDa不等，作用的底物有一定的重疊性，其中明膠酶的作用主要是清除變性的膠原和Ⅳ型膠原。

而Ⅳ型膠原是組成血管基底膜和細胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)蛋白，因而明膠酶MMP-2作為主要降解Ⅳ型膠原的基質(zhì)金屬蛋白酶在新生血管形成過程中起著重要作用[5]。

研究表明，MMP-2與新生血管形成密切相關(guān)[6]。

MMP-2通過降解變性的膠原和基底膜Ⅳ型膠原，有利于血管內(nèi)皮細胞的遷移，并為毛細血管網(wǎng)絡(luò)增生提供了空間，而基底膜和間質(zhì)膠原的降解產(chǎn)物對內(nèi)皮細胞也有趨化作用，有利于血管內(nèi)皮細胞的定向遷移，從而引起新生血管的形成。

一些研究團體已經(jīng)檢測了在視網(wǎng)膜新生血管中MMPs的表達形式和可能的作用。

Das等[7]報道糖尿病人視網(wǎng)膜外層新生血管膜含有高水平的細胞外蛋白水解酶，其中包含MMP-2、MMP-9和尿激酶。

Majka等[8]報道在小鼠增殖性視網(wǎng)膜病變模型中MMP-2、MMP-9和I型MMP的表達增加。

Das等[9]報道氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變模型中，腹膜內(nèi)注射MMPs抑制劑可顯著抑制視網(wǎng)膜新生血管的生成。

我們通過建立高氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管小鼠模型，發(fā)現(xiàn)高氧組MMP-2的表達明顯高于對照組，提示MMP-2與視網(wǎng)膜新生血管生成之間存在關(guān)聯(lián)。

KyokoOhno-Matsui，TomokoUetama等[10]建立了氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變小鼠模型，發(fā)現(xiàn)MMP-2缺乏型(MMP-2-/-)的小鼠視網(wǎng)膜外新生血管形成明顯少于野生型小鼠(MMP-2+/+)，這也可以證實我們的結(jié)論。

因此認為MMP-2可能是視網(wǎng)膜新生血管形成的調(diào)節(jié)中所必須的。

也有研究認為[11]，MMP-2無論對小鼠視網(wǎng)膜血管生成還是病理性視網(wǎng)膜新生血管生成都不是必不可少的。

用MMP-2抑制劑進行干預(yù)將成為治療早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病及其他新生血管性視網(wǎng)膜病的新途徑。

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