Claudin 18.2伴隨診斷試劑開發(fā)及案例分享

Claudin

18.2伴隨診斷關(guān)鍵試劑開發(fā)及案例分享

北京義翹神州科技股份有限公司義翹神州義翹神州伴隨診斷助力K藥打了翻身仗2016年6月，默沙東宣布，Keytruda一線單藥治療PD-L1陽性表達(dá)（PD-L1≥50%）晚期NSCLC的keynote-024關(guān)鍵III期研究因?yàn)檫_(dá)到主要終端（PFS和OS）而提前終止。2016年8月5日，BMS宣布Opdivo一線單藥治療PD-L1陽性表達(dá)（PD-L1＞5%）晚期NSCLC的CheckMate-026關(guān)鍵III期研究未能達(dá)到PFS的主要終點(diǎn)。VSCONTENT免疫組化伴隨診斷試劑概述1義翹神州診斷抗體開發(fā)策略2Claudin

18.2的判讀標(biāo)準(zhǔn)3Claudin

18.2的染色評價(jià)4免疫組化伴隨診斷試劑概述01義翹神州伴隨診斷（CompanionDiagnostics）義翹神州2014年，F(xiàn)DA發(fā)布伴隨診斷指南，正式提出伴隨診斷的定義，明確了伴隨診斷產(chǎn)品是能夠?yàn)橄鄳?yīng)的治療性產(chǎn)品安全有效的應(yīng)用提供關(guān)鍵性信息的體外診斷產(chǎn)品。2016年FDA發(fā)布伴隨診斷產(chǎn)品如何與治療性產(chǎn)品共同開發(fā)的指南草案.在該草案中指出作為伴隨診斷試劑，最好在藥物臨床試驗(yàn)開展前，試劑的分析性能基本已確定并能夠滿足藥物的要求。在藥物臨床試驗(yàn)中伴隨診斷試劑為入組人群提供關(guān)鍵性信息，最終藥物和試劑同時(shí)獲得上市批準(zhǔn)。2020年FDA正式發(fā)布了對于同類治療性產(chǎn)品的伴隨診斷試劑說明書更新的指南，對同時(shí)伴隨同一類治療性產(chǎn)品的伴隨診斷試劑說明書的更新進(jìn)行了規(guī)范。上市申報(bào)途徑premarketapproval，PMAPremarketNotification510(k)2個(gè)HumanitarianDeviceExemption，HDE

2個(gè)123《以臨床價(jià)值為導(dǎo)向的抗腫瘤藥物臨床研發(fā)指導(dǎo)原則》《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》《基于同類治療藥品的腫瘤伴隨診斷試劑說明書更新與技術(shù)審查指導(dǎo)原則(征求意見稿)》義翹神州伴隨診斷的發(fā)展截至目前，F(xiàn)DA獲得批準(zhǔn)的免疫組化伴隨診斷分子有3個(gè)：HER-2、Ki-67、PD-L1。1998年批準(zhǔn)的HER-2伴隨診斷，用于明確哪些患者屬于HER-2異常擴(kuò)增，以便對癥使用赫賽?。籏i-67與HR、HER-2聯(lián)用定義高危早期乳腺癌患者，以便其使用阿貝西利聯(lián)合內(nèi)分泌療法；PD-L1免疫組化（IHC）檢測已被批準(zhǔn)作為免疫治療的伴隨或補(bǔ)充診斷，作為免疫治療的療效預(yù)測標(biāo)志物，是目前公認(rèn)臨床證據(jù)最為充足且最容易實(shí)現(xiàn)臨床檢測的標(biāo)志物。廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤中，以識別或輔助預(yù)測可能從免疫治療中獲益的患者。/medical-devices/in-vitro-diagnostics/list-cleared-or-approved-companion-diagnostic-devices-in-vitro-and-imaging-tools義翹神州檢測抗體一致性-藍(lán)印計(jì)劃5個(gè)藥品，5種方法2017年，國際肺癌研究協(xié)會（InternationalAssociationfortheStudyofLungCancer,IASLC）牽頭發(fā)起藍(lán)印計(jì)劃（TheBlueprintProject,BP）義翹神州claudin18.2做為藥物靶點(diǎn)的潛能被發(fā)掘2008年，被科學(xué)家Sahin發(fā)現(xiàn)CLDN18.2是一種高度選擇性的分子，并且只在癌細(xì)胞中廣泛表達(dá)，它就成為一種理想的靶點(diǎn)2016年ASCO年會上由Ganymed公司第一次公布了IMAB362的臨床數(shù)據(jù)。

數(shù)據(jù)顯示claudin18.2陽性率超過40%的腫瘤病人能夠從IMAB362治療中獲益Claudin18.2診斷抗體開發(fā)策略02義翹神州義翹神州claudin18的功能緊密連接是正常上皮細(xì)胞與細(xì)胞粘附的重要功能組成部分，通過機(jī)械的方式連接細(xì)胞，形成上皮屏障，組織細(xì)胞間的大分子運(yùn)輸，維持上皮極性。構(gòu)成緊密連接的蛋白有多種，其中claudin蛋白和occladudin蛋白是最關(guān)鍵的蛋白。ItaruHashimotoandTakashiOshima,ClaudinsandGastricCancer:AnOverview.義翹神州抗體開發(fā)流程通常一個(gè)抗體的誕生主要包括四個(gè)環(huán)節(jié)：免疫，抗體篩選，抗體純化和抗體驗(yàn)證免疫免疫原選擇免疫原制備宿主生物系統(tǒng)免疫方案篩選高通量篩選方法抗體純化蛋白A抗原親和純度內(nèi)毒素應(yīng)用鑒定WB,IHC,FCM等特異性識別多種天然樣本劑量，途徑，佐劑，周期等義翹神州免疫原的選擇抗原類型適用情況優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)蛋白天然蛋白構(gòu)象/線性表位結(jié)構(gòu)正確，抗體易識別天然樣本表達(dá)量低，不易獲得足夠的免疫原，純化困難重組蛋白構(gòu)象/線性表位產(chǎn)量高，表達(dá)純化技術(shù)成熟跟天然蛋白結(jié)構(gòu)有差異多肽線性表位容易合成，純度高修飾特異性抗體種屬特異性/交叉抗體低免疫原性，不具有天然結(jié)構(gòu)DNA構(gòu)象/線性表位無需純化蛋白蛋白體內(nèi)表達(dá)，更近天然結(jié)構(gòu)低免疫原性細(xì)胞構(gòu)象/線性表位結(jié)構(gòu)正確，抗體已識別天然樣本細(xì)胞表面蛋白種類復(fù)雜，靶蛋白免疫劑量偏低，影響免疫效果；難度大義翹神州免疫原分析和設(shè)計(jì)ELISAFCMIPWBIHCIF天然蛋白構(gòu)象表位變性或半變性蛋白線性表位ModelstructureofclaudinproteinPrabhsimranjotSingh,SudhamshiToomandYiwuHuang.Anti-claudin18.2antibodyasnewtargetedtherapyfor

advancedgastriccancer.2017親水性，表面可及性和柔性義翹神州宿主生物系統(tǒng)鼠兔費(fèi)用低高類別轉(zhuǎn)換亞型類別轉(zhuǎn)換只有一個(gè)型生產(chǎn)周期短長多樣性和親和力差強(qiáng)多肽片段等免疫原更難更容易交叉反應(yīng)強(qiáng)無哺乳動物：鼠、綿羊、兔子、山羊雞硬骨魚駱駝型IgGIgAIgDIgEIgMIgYIgT,IgZHcAbs亞型IgGIgG1IgG2a-cIgG3IgG4IgA1IgA2IgDIgEIgMIgMNone重鏈γ1γ2γ3γ4α1α2δεμντζ輕鏈λκλκλκλκκκλκαλκα義翹神州動物免疫方案免疫劑量選擇免疫途徑與部位大鼠50ug-200ug/次皮下皮內(nèi)靜脈脾內(nèi)肌肉小鼠10ug-50ug/次足墊背部腹部耳緣淋巴結(jié)周圍兔子100ug-500ug/次SinoBiologicalInc.篩選方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)雜交瘤技術(shù)操作流程成熟研發(fā)成本低，認(rèn)可度高所制備單克隆抗體特異性好性價(jià)比高，不依賴于設(shè)備制備周期長基因重排出現(xiàn)非功能輕鏈藥物研發(fā)抗體需要進(jìn)行人源化噬菌體展示基因型與表現(xiàn)型建立聯(lián)系，將重組蛋白篩選與基因篩選合二為一展示抗體來源于多種B細(xì)胞類型可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募安煌瑧?yīng)用，靈活，特異的設(shè)計(jì)篩選方案長時(shí)間保存VL/VH天然配對展示效率存在偏好性。由于是原核表達(dá)，翻譯后修飾等受到限制定性檢測，需要全抗驗(yàn)證功能活性單細(xì)胞VL/VH天然配對分選抗原特異性B細(xì)胞特異性好，親和力高，基因多樣性豐富新鮮的樣本組織，如PBMC抗原特異性細(xì)胞比例低，對抗原要求高操作環(huán)境嚴(yán)格抗體篩選平臺根據(jù)FDA數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì)，全球批準(zhǔn)上市的91個(gè)單抗藥品中，超過95%的品種為來自雜交瘤平臺雜交瘤平臺仍然占比最高單抗名稱亞型上市日期AdalimumabIgG12002年BelimumabIgG12011年Ranibizumab/2006年RaxibacumabIgG12012年NecitumumabIgG12015年噬菌體做為第二代平臺發(fā)展速度很快單細(xì)胞測序技術(shù)提速抗體研發(fā)義翹神州篩選方案應(yīng)用類型盲篩成功率介入篩選成功率結(jié)果分類成功率IHC24%51.7%I類染色優(yōu)秀83%Ⅱ類染色尚可75%Ⅲ類有染色，同時(shí)有背景43%FACS33%67.1%I類90%Ⅱ類84%Ⅲ類53%Target免疫原融合細(xì)胞數(shù)ELISAIHCClaudin18.1&2sinoA99162640252陽性樣本陰性樣本義翹神州篩選方案tissueRNAcDNASCFVphagemidTransformationinfectionlibraryR179-胃癌Target免疫原庫容表達(dá)抗體IHCClaudin18.1&2sinoA99165*10^8146Claudin18.2的用法和判讀標(biāo)準(zhǔn)02義翹神州Claudin18.2的用法切片3-5μm58?60°C烤片1小時(shí)脫蠟-水化pH9.0EDTA抗原修復(fù)15min

冷卻10min洗滌3%過氧化氫內(nèi)源性生物素室溫封閉洗滌43-14A單克隆抗體室溫孵育30min洗滌HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗孵育封片顯色觀察DAB顯色5min義翹神州手動染色流程Claudin18.2的判讀標(biāo)準(zhǔn)：43-14A免疫組化IRS評分義翹神州無（0分）弱（1分）中（2分）強(qiáng)（3分）0%（0分）00001–25%（1分）012326–50%（2分）024651–75%（3分）036976–100%（4分）04812染色強(qiáng)度染色百分比IRS>8分，Claudin18.2陽性腫瘤組織IRS≤8分，Claudin18.2陰性腫瘤組織CLAUDETECT?18.2immunohistochemistryassay[Ganymed,Germany]，克隆號為43-14A義翹神州Claudin18.2的判讀標(biāo)準(zhǔn)-43-14ASahin,etal.FAST:arandomisedphaseIIstudyofzolbetuximab(IMAB362)plusEOXversusEOXaloneforfirst-linetreatmentofadvancedCLDN18.2-positivegastricandgastro-oesophagealadenocarcinoma?zlemTüreci,etal.Characterizationofzolbetuximabinpancreaticcancermodels義翹神州Claudin18.2的判讀標(biāo)準(zhǔn)：抗體EPR19202DottermuschMetal.Expressionofthepotentialtherapeutictargetclaudin-18.2isfrequentlydecreasedingastriccancer:resultsfromalargeCaudasiancohortstudyi)Negative：無表達(dá)ii)low-gradeexpression：低水平表達(dá) 5%-49%的腫瘤細(xì)胞表達(dá)iii)high-gradeexpression：高水平表達(dá)

大于49%腫瘤細(xì)胞表達(dá)義翹神州Claudin18.2的使用方法和判讀標(biāo)準(zhǔn)密度1+密度2+密度3+百分比＜40%弱陽性弱陽性弱陽性百分比＜40%小于69%弱陽性中度陽性中度陽性百分比≥70%弱陽性強(qiáng)陽強(qiáng)陽ChangsongQi,etal.Claudin18.2-specificCARTcellsingastrointestinalcancers:phase1trialinterimresultsCR41:clone14F8,predilutedmousemonoclonalantibody,CARsgenmadein-house百分比計(jì)算方式=視野中所有的腫瘤細(xì)胞個(gè)數(shù)CLDN18.2染色細(xì)胞個(gè)數(shù)×100%Claudin18.2的染色評價(jià)03義翹神州分析特異性評價(jià)：通過腫瘤和正常組織驗(yàn)證抗體的反應(yīng)性分析靈敏度測試：陽性檢出的能力可重復(fù)性：不同評分組別進(jìn)行intra-run和intra-day/run的測試實(shí)驗(yàn)室間再現(xiàn)性評價(jià)耐用性測試：針對不同厚度，不同修復(fù)時(shí)間，修復(fù)溫度，修復(fù)液pH耐受性腫瘤異質(zhì)性評價(jià)：不同時(shí)期的腫瘤，同一個(gè)體不同蠟塊，同一蠟塊不同切片穩(wěn)定性測試：試劑盒的穩(wěn)定性，切片穩(wěn)定性伴隨診斷試劑的實(shí)驗(yàn)室研究評價(jià)義翹神州組化結(jié)果評價(jià)——一致性43-14A義翹神州肺胃胃癌胃癌胃癌胃癌胰腺癌胃癌43-14A義翹神州Claudin18抗體正常組織的表達(dá)情況扁桃體膽囊肝睪丸肌肉甲狀腺結(jié)腸闌尾淋巴結(jié)腦皮膚脾氣管前列腺乳腺腎腎上腺食管胎盤小腸心胸腺胰腺支氣管直腸義翹神州義翹神州組化結(jié)果評價(jià)——多實(shí)驗(yàn)室反饋AdjacentTumorCLDN18.2IHCstain