義翹講堂《高質(zhì)量重組蛋白制備策略與方法》

北京義翹神州科技股份有限公司高質(zhì)量重組蛋白制備策略與方法CONTENT義翹神州簡介1重組表達(dá)技術(shù)平臺(tái)2重組蛋白表達(dá)和純化策略3總結(jié)4義翹神州義翹神州簡介01義翹神州CompanyOverview硬件設(shè)施:~29,000m2超過27,100平米的研發(fā)生產(chǎn)中心超過1,900平米的潔凈生產(chǎn)車間我們的客戶:6,000+產(chǎn)品與服務(wù)已推廣至全球90多個(gè)國家地區(qū)，涵蓋全球Top20生物制藥企業(yè)、生物科技公司、診斷試劑公司、科研院所、知名大學(xué)、頂級醫(yī)院等人才隊(duì)伍:770+碩士及以上學(xué)歷人才：130+現(xiàn)貨產(chǎn)品:52,000+碩士及以上學(xué)歷人才：130+北京義翹神州主要從事生物試劑研發(fā)、生產(chǎn)、銷售并提供技術(shù)服務(wù),主要業(yè)務(wù)包括重組蛋白、抗體、基因和培養(yǎng)基等產(chǎn)品以及重組蛋白、抗體的開發(fā)和生物分析檢測等服務(wù)。公司概況義翹神州CompanyOverview領(lǐng)先的技術(shù)平臺(tái)全方位的技術(shù)能力分子構(gòu)建細(xì)胞培養(yǎng)蛋白純化動(dòng)物免疫抗體篩選規(guī)?；a(chǎn)質(zhì)量檢測完善的蛋白表達(dá)技術(shù)平臺(tái)領(lǐng)先的抗體開發(fā)技術(shù)平臺(tái)四大蛋白表達(dá)體系多樣化的抗體開發(fā)技術(shù)義翹神州CompanyOverview完善的質(zhì)量控制體系UVSDS-PAGESEC-HPLCMALS內(nèi)毒素理化類檢測技術(shù)價(jià)值數(shù)千萬的理化檢測儀器，可提供蛋白、抗體等的含量、純度、內(nèi)毒素、高級結(jié)構(gòu)以及LC、MS、HPLC、N端測序等相關(guān)檢測。BiacoreFlowCytometryIP/Co-IPIFIHCWesternBlotELISAOctet免疫學(xué)檢測技術(shù)義翹神州建立了全面的免疫學(xué)檢測平臺(tái)，可分別從組織水平、蛋白/抗體分子水平、細(xì)胞水平等進(jìn)行免疫學(xué)檢測。功能性活性評估技術(shù)義翹神州已建立近300種配體受體檢測模型、400+蛋白活性檢測方法，可用于包括結(jié)合活性評估、多種酶、激酶的體外活性評、細(xì)胞活性評估等。1.結(jié)合活性：基于配體受體結(jié)合的蛋白ELISA水平和生物大分子相互作用分析。2.細(xì)胞活性：基于蛋白抗體本身功能，可在細(xì)胞水平評價(jià)其對細(xì)胞的增殖、抑制、分化、黏附、趨化、分泌、凋亡及抗體的ADCC、CDC等作用。結(jié)合活性檢測抗體活性評價(jià)酶、激酶活性檢測細(xì)胞因子活性檢測假病毒中和檢測血凝活性檢測全面的質(zhì)量體系認(rèn)證先進(jìn)的檢測設(shè)備義翹神州CompanyOverview多種試劑類型，可應(yīng)用于多個(gè)研究領(lǐng)域自主研發(fā)生產(chǎn)現(xiàn)貨供應(yīng)生物試劑可應(yīng)用于6,500+重組蛋白14,000+抗體32,000+基因GMP級別核酸酶無血清細(xì)胞培養(yǎng)基600+試劑盒診斷試劑開發(fā)免疫學(xué)研究大分子藥物研究疫苗開發(fā)結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究表觀遺傳學(xué)干細(xì)胞研究心血管研究細(xì)胞生物學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究腫瘤研究病毒研究義翹神州CompanyOverview覆蓋基因、蛋白、抗體領(lǐng)域，從研發(fā)到生產(chǎn)、檢測的“一站式”技術(shù)服務(wù)CRO服務(wù)抗體制備服務(wù)重組抗體生產(chǎn)服務(wù)重組蛋白表達(dá)服務(wù)ELISA試劑盒開發(fā)服務(wù)免疫檢測服務(wù)生物安全檢測服務(wù)生物檢測服務(wù)過表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建服務(wù)親和力檢測服務(wù)免疫印跡(WesternBlot)檢測服務(wù)免疫組化(IHC)/免疫熒光(IF)單染檢測服務(wù)多重染色服務(wù)HE染色及特殊染色服務(wù)流式細(xì)胞(FCM)檢測服務(wù)ELISA檢測服務(wù)IP/Co-IP技術(shù)服務(wù)病毒滅活/清除驗(yàn)證服務(wù)細(xì)胞庫檢測服務(wù)最快12天即可完成從基因合成到100mg真核蛋白表達(dá)的開發(fā)和生產(chǎn)義翹神州重組表達(dá)技術(shù)平臺(tái)02義翹神州蛋白質(zhì)是生命之本IntrotoRecombinantTechnologies/about-nci/organization/ccg/blog/2020/intro-proteogenomics-central-dogma/chemistry/protein-structure-and-levels-of-protein/分子生物學(xué)中心法則TransportRegulationCNSRegenerationCatalystFluidbalanceSignallingImmunityStructuralproteinsMobility蛋白質(zhì)：生命活動(dòng)的直接執(zhí)行者義翹神州重組表達(dá)技術(shù)核心概念重組蛋白的應(yīng)用生物藥結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究細(xì)胞培養(yǎng)天然vs重組蛋白天然蛋白重組蛋白豐度豐度低無豐度限制動(dòng)物源有無動(dòng)物源產(chǎn)率低高批間差高可控andsomuchmore…工業(yè)酶催化生物材料藥物開發(fā)診斷試劑IntrotoRecombinantTechnologies義翹神州重組表達(dá)技術(shù)關(guān)鍵因素表達(dá)載體（質(zhì)粒）

線性雙鏈DNA分子

啟動(dòng)子：基因轉(zhuǎn)錄起始處MCS：插入目的基因

抗性基因：輔助篩選宿主細(xì)胞HEK293/CHOInsectcellE.coliYeast分泌表達(dá)蛋白或抗體，天然PTM，正確折疊較長培養(yǎng)周期，成本相對較高可溶蛋白，高密度培養(yǎng)，正確折疊和一定的PTM

糖基化糖鏈較短，成本相對較高低成本，表達(dá)快速，易放大無PTM,包涵體，重組表達(dá)蛋白分子量上限相對較低低成本，表達(dá)快速，易放大高度mannose糖基化PTM*PTM=翻譯后修飾，包括糖基化，磷酸化，乙酰化等純化方法（柱層析）

蛋白質(zhì)/抗體的理化性質(zhì)決定純化方案的設(shè)計(jì)

蛋白關(guān)鍵理化指數(shù)：純化標(biāo)簽（i你和層析），分子量（蛋白大?。入婞c(diǎn)（電性電勢分布），疏水性…

常用純化介質(zhì)：親和，離子交換，分子篩，疏水層析，吸附層析，反向…/chemistry/differential-extraction-chromatography/IntrotoRecombinantTechnologies義翹神州目的基因?qū)隕.coilandyeast化學(xué)轉(zhuǎn)化(E.coli)電轉(zhuǎn)化(E.coli,yeast)昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒介導(dǎo)基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建IntrotoRecombinantProteins義翹神州哺乳動(dòng)物細(xì)胞（瞬時(shí)轉(zhuǎn)染）M1+T1M1+T2M2+T2M2+T2M1+T2WeakGFP+StrongGFP+配套試劑適配程度決定哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)效率HEK293FTDG44SBICompetitor提高抗體表達(dá)量

選擇20株低表達(dá)量抗體(<20mg/L)

通過使用不同培養(yǎng)基配方和轉(zhuǎn)染試劑排列組合優(yōu)化培養(yǎng)條件選擇兩代培養(yǎng)基(M1andM2)

選擇兩種配比轉(zhuǎn)染試劑(T1andT2)

相同培養(yǎng)體積，培養(yǎng)周期和溫度一步ProteinA親和純化抗體目的基因?qū)隝ntrotoRecombinantTechnologies義翹神州重組蛋白表達(dá)和純化策略03義翹神州重組表達(dá)策略制定CaseStudies:RecombinantExpressionProteinIDAccession#(UniPortorNCBI)AA/cDNAsequenceBasicparametersStructuralFeaturesReferenceDisordernessCyscontentS-SprofileHydrophobicitydistributionInstabilityprofileAssessmentMw,pI…TM,PTM,domainsConstructHost,construct,affinitytag,QCmethodsandstandardsPilotPOCScale-upFeasibilityassessmentTrouble-shootingFormulation,activity,stability…蛋白最終應(yīng)用決定表達(dá)和純化策略義翹神州構(gòu)建設(shè)計(jì)方案截去影響蛋白表達(dá)的區(qū)段Construct1Construct2

單次跨膜蛋白胞外區(qū)(MW=~90KDa)

昆蟲細(xì)胞表達(dá)

純化分泌蛋白

刪去N端高疏水區(qū)促進(jìn)蛋白分泌表達(dá)功能區(qū)域串聯(lián)表達(dá)Full-length(2511AA)，~70%purity,Yield<0.5mg/LEnoylreductase+Ketoacylreductase(~1000AA)Methyltransferase+Ketoreductase(~700AA)>90%purity,Yield>20mg/L

重組人脂肪酸合成酶（FASN）

多功能域復(fù)合酶昆蟲細(xì)胞表達(dá)純化胞內(nèi)蛋白

通過功能區(qū)串聯(lián)獲得高產(chǎn)重組蛋白CaseStudies:RecombinantExpression義翹神州宿主細(xì)胞對重組表達(dá)的影響

重組表達(dá)新冠NP蛋白(MWofmonomer=~45KDa)

首先使用昆蟲細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)嘗試，后使用不同的E.coli菌株進(jìn)行蛋白表達(dá)

選取適合的E.coli表達(dá)菌株可促進(jìn)蛋白的表達(dá)和純化Oligomer=34%BufferoptimizedOligomer=50%昆蟲細(xì)胞表達(dá)SwitchhostE.coli

菌株1E.coliMW:~330kDaLot1Lot1,FTx3Ye,

Q,.etal.ProteinSci.

2020,29:1890–1901.

DOI:10.1002/pro.3909Kang,S.,etal.,ActaPharmaceuticaSinicaB,DOI:10.1016/j.apsb.2020.04.009E.coli

菌株2CaseStudies:RecombinantExpression義翹神州分子伴侶的使用“通用型”分子伴侶DimmercontentNochaperone0hr,~8%dimmer

目標(biāo)蛋白需形成同源二聚體方可確?；钚哉_HEK293細(xì)胞表達(dá)

純化分泌蛋白

使用通用型分子伴侶促進(jìn)蛋白正確折疊和組裝MonomerDimmerMonomerDimmerDimmerNochaperone48hr,~25%dimmerW/chaperone0hr,~95%dimmer116.066.245.035.00hr48hrChaperoneRPuritySampleActivity(Unit)Nochaperone,0hr200Nochaperone,48hr800W/chaperone,0hr4000Hydrolysisactivity特殊分子伴侶

目標(biāo)蛋白需被宿主細(xì)胞切割活化后方可確?；钚哉_

切割活化后蛋白兩個(gè)亞基通過分子間二硫鍵相連HEK293細(xì)胞表達(dá)純化分泌蛋白

根據(jù)目標(biāo)蛋白所在生物學(xué)通路，選取其上游激活蛋白與目標(biāo)蛋白共轉(zhuǎn)表達(dá)NochaperoneW/chaperoneSampleIntactproteinActivity(Unit)Nochaperone44%4500W/chaperone0%16000ProteinSplicingCaseStudies:RecombinantExpression義翹神州純化策略緩沖液成分優(yōu)化純化工藝優(yōu)化

表達(dá)和純化雙抗：scFv-KIHbsAbHEK293細(xì)胞表達(dá)

純化分泌抗體

多步驟純化策略以獲得正確形式的抗體

全長單次跨膜蛋白(MW=~50KDa)

昆蟲細(xì)胞表達(dá)

純化胞內(nèi)蛋白,Ni+SEC

優(yōu)化緩沖液中去垢劑成分以促進(jìn)蛋白的提取和穩(wěn)定PBSwithDetergent1PBSwithDetergent2PBSwithDetergent3Step1:ProteinA-affinityPAGE>95%Monomer:43.9%MonomerAggregatesandmis-matchedchains(K-KandH-H)pIH-H>pIK-H>pIK-KStep2:IonexchangeH-HK-HK-KMonomerMonomer:41.8%Step3:GelfiltrationMonomerPAGE>95%Monomer:98.5%CaseStudies:RecombinantExpression義翹神州整體策略優(yōu)化CaseStudies:RecombinantExpression

重組表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子蛋白

蛋白高度無序，穩(wěn)定性差昆蟲細(xì)胞表達(dá)純化胞內(nèi)蛋白

構(gòu)建、培養(yǎng)和純化過程綜合優(yōu)化Construct1:Nt-GST-TF,pilotN端融合標(biāo)簽觀察到目標(biāo)蛋白表達(dá)

目標(biāo)蛋白未GSH梯度洗脫

目標(biāo)蛋白降解嚴(yán)重Construct2:Nt-TF-GST,pilot(V1)Construct2:Nt-TF-GST,scale-up

培養(yǎng)體積=10XV1

蛋白降解

培養(yǎng)體積=V1

收集Elute2并置換Buffer

目標(biāo)蛋白在高鹽buffer中較為穩(wěn)定Buffer[NaC