DNA測序技術的原理發(fā)展及在醫(yī)學中的應用

DNA測序技術的原理發(fā)展及在醫(yī)學中的應用DNA測序技術DNA是一種長鏈聚合物，組成單位為四種脫氧核苷酸(dATPdTTPdCTPdGTP)。這些堿基沿著DNA長鏈所排列而成的序列，可組成遺傳密碼，指導蛋白質的合成。測序分析能夠為基因DNA序列提供最真實可靠的信息，它可以比較全面地描述基因的復雜性和多樣性。DNA測序技術測定未知序列研究基因組多樣性確定重組DNA的方向與結構對突變進行定位和鑒定DNA測序的發(fā)展歷程經典DNA測序技術70年代末，Maxam和Gilbert發(fā)明化學法、Sanger發(fā)明雙脫氧終止法手動測序（同位素標記）80年代中期，出現(xiàn)自動測序儀（應用Sanger雙脫氧終止法原理）、熒光代替同位素，采用計算機圖象識別90年代中期，測序儀重大改進、集束化的毛細管電泳代替凝膠電泳2001年完成人類基因組框架圖，全部采用基于Sanger雙脫氧原理的自動化毛細管測序。DNA測序的發(fā)展歷程DNA測序的發(fā)展歷程第二代測序技術DNA測序的發(fā)展歷程454的特點與主要應用讀長較長，400－600bp通量較低，400－600Mb相對成本較高主要應用：denovo測序DNA測序的發(fā)展歷程Solexa的特點與主要應用讀長較短，100－150bp通量高主要應用：RNA測序、表觀遺傳學研究不需要進行酶催化反應，因此不會產生由于酶催化反應而帶來的誤差；化學降解測序法特別適用于測定含有如5-甲基腺嘌呤A或者G，C含量較高的DNA片段，以及短鏈的寡核苷酸片段的序列。DNA序列分析的自動化讀長較短，50-75bp測序酶是一種經過修飾的T7噬菌體DNA聚合酶，消除了3′→5′外切酶活性。對未經克隆的DNA片段可以直接測序；Solexa的特點與主要應用②用堿性磷酸化酶處理該片段，消除5′末端上的磷酸；DNA是一種長鏈聚合物，組成單位為四種脫氧核苷酸(dATPdTTPdCTPdGTP)。目前,僅在分析特殊DNA鏈的核苷酸序列和分析DNA和蛋白質相互作用中的DNA一級結構時才使用DNA測序在醫(yī)學中的應用Maxam-GilbertDNA化學降解法雙脫氧鏈末端合成終止法DNA測序的發(fā)展歷程SOLiD的特點與主要應用讀長較短，50-75bp精度高，通量高，主要應用：基因組重測序、SNP檢測等DNA測序的發(fā)展歷程三種第二代測序技術對比DNA測序的發(fā)展歷程第三代測序技術第二代測序技術在制備測序文庫的時候都需要經過PCR擴增，而這一PCR過程可能引入突變或者改變樣品中核酸分子的比例關系。另外，第二代測序的讀長普遍偏短，在進行數(shù)據(jù)拼接時會遇到麻煩。為了克服這樣的缺點，業(yè)界發(fā)展出了以單分子實時測序和納米孔為標志的第三代測序技術。DNA測序的發(fā)展歷程第三代測序技術

雙脫氧鏈末端合成終止法1977年，英國人FrederickSanger創(chuàng)建了雙脫氧鏈末端合成終止法（chainterminationmethod），簡稱Sanger法、雙脫氧法或酶法。他發(fā)現(xiàn)如果在DNA復制過程中摻入ddNTP，就會產生一系列末端終止的DNA鏈，并能通過電泳按長度分辨。不同末端終止DNA鏈的長度是由摻入到新合成鏈上隨機位置的ddNTP決定的。雙脫氧鏈末端合成終止法雙脫氧鏈末端合成終止法雙脫氧鏈末端合成終止法雙脫氧鏈末端合成終止法基本原理是利用DNA聚合酶，以待測單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，設立四種相互獨立的測序反應體系，在每個反應體系中加入不同的雙脫氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleosidetriphosphate，ddNTP）作為鏈延伸終止劑。在測序引物引導下，按照堿基配對原則，每個反應體系中合成一系列長短不一的引物延伸鏈，通過高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測后，從凝膠底部到頂部按5′→3′方向讀出新合成鏈序列，由此推知待測模板鏈的序列。雙脫氧鏈末端合成終止法測序時分成四個反應,每個反應除上述成分外分別加入2,3-雙脫氧的A,C,G,T核苷三磷酸（稱為ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP）,然后進行聚合反應。在第一個反應中,ddATP會隨機地代替dATP參加反應，一旦ddATP加入了新合成的DNA鏈，由于其第3位的-OH變成了-H,所以不能繼續(xù)延伸,于是第一個反應中所產生的DNA鏈都是到A就終止了。具體操作雙脫氧鏈末端合成終止法雙脫氧鏈末端合成終止法引物

在DNA聚合酶催化的測序反應中需要測序引物。不論是單鏈DNA模板，還是雙鏈DNA模板，都可通過使用克隆位點兩側的載體序列互補的“通用”引物。通用引物的長度一般為15～30個核苷酸。如果是PCR產物直接測序，也可以用一端的PCR引物雙脫氧鏈末端合成終止法測序酶（sequenase）測序酶是一種經過修飾的T7噬菌體DNA聚合酶，消除了3′→5′外切酶活性。該酶活性非常穩(wěn)定，具有很高的鏈延伸能力和極快的聚合反應速度，是測定較長DNA的首選酶。雙脫氧鏈末端合成終止法測序產物的凝膠電泳及識讀能否將測序反應中產生的各種不同長度的DNA片段進行有效分離是序列分析成敗的關鍵。最早采用放射性標記引物，后來采用熒光劑標記。DNA序列分析的自動化激光測序法終止標記系統(tǒng)是用4種不同的熒光染料標記不同的ddNTP。測序反應可以在同一反應管內進行，不必分成4管，反應產物按終止位置的堿基不同其3′末端帶有不同的熒光基團，被激發(fā)后產生不同的熒光，將反應產物加樣于凝膠的同一加樣孔，電泳分離后，經過DNA測序儀分析系統(tǒng)識別，將檢測將信號不斷傳送到計算機，通過軟件分析，自動讀出待測DNA的全部核苷酸序列。DNA序列分析的自動化DNA序列分析的自動化毛細管電泳

毛細管電泳（Capillaryelectrophoresis,CE）是以高壓直流電場為驅動力，在毛細管內使荷電粒子按淌度或分配系數(shù)進行分離的一種電泳技術。具有分辨率高、重現(xiàn)性好、靈敏度高、快速和易于實現(xiàn)自動化等優(yōu)點Maxam-GilbertDNA化學降解法基本原理：直接或間接特異性識別4種堿基特定化學試劑可對堿基進行特異性修飾在修飾堿基處(5‘或3’)打斷磷酸二酯鍵將一個DNA片段的5'端磷酸基作放射性標記，再分別采用不同的化學方法修飾和裂解特定堿基，從而產生一系列長度不一而5'端被標記的DNA片段，這些以特定堿基結尾的片段群通過凝膠電泳分離，再經放射線自顯影，確定各片段末端堿基，從而得出目的DNA的堿基序列。Maxam-GilbertDNA化學降解法操作步驟①先用限制性內切酶把DNA切成10—200bp的測序材料；②用堿性磷酸化酶處理該片段，消除5′末端上的磷酸；③在5′OH端標記32P，用多核苷酸磷酸激酶催化；④標記片段變性為單鏈；⑤用特異的化學試劑作用于不同的堿基進行修飾，然后用哌啶甲酸切斷反應堿基的多核苷酸鏈，緊接著用四組不同的特異反應可以使末端標記的DNA分子切成不同長度的片段，產生一組其末端都是該特異堿基的長度不等的DNA片段；⑥經電泳和放射性自顯影后，從4個反應系統(tǒng)統(tǒng)一閱讀，待測DNA的全部核苷酸序列就可直接讀出Maxam-GilbertDNA化學降解法Maxam-GilbertDNA化學降解法2001年完成人類基因組框架圖，全部采用基于Sanger雙脫氧原理的自動化毛細管測序。在堿性環(huán)境中作用于胞嘧啶C和胸腺嘧啶T的C4和C6位置導致糖苷鍵斷裂。90年代中期，測序儀重大改進、集束化的毛細管電泳代替凝膠電泳5-*GATCACTACTG-Maxam-GilbertDNA化學降解法④標記片段變性為單鏈；Maxam-GilbertDNA化學降解法讀長較短，50-75bp5′-*GATCACTACHGP對人類疾病基因研究的貢獻1977年，英國人FrederickSanger創(chuàng)建了雙脫氧鏈末端合成終止法（chainterminationmethod），簡稱Sanger法、雙脫氧法或酶法。不需要進行酶催化反應，因此不會產生由于酶催化反應而帶來的誤差；雙脫氧鏈末端合成終止法Maxam-GilbertDNA化學降解法雙脫氧鏈末端合成終止法在堿性環(huán)境中作用于胞嘧啶C和胸腺嘧啶T的C4和C6位置導致糖苷鍵斷裂。Maxam-GilbertDNA化學降解法該反應的關鍵在于使DNA的4種核苷酸中，只有1-2種發(fā)生特異性的化學切割反應：堿基的特異性修飾；修飾的堿基從核糖環(huán)上轉移；失去堿基的糖環(huán)部位發(fā)生DNA鏈斷裂。專門用來對核苷酸作化學修飾，并打斷磷酸二酯鍵的化學試劑有硫酸二甲酯（dimethylsulphate)和肼(hydrazine)、哌啶甲酸等。Maxam-GilbertDNA化學降解法

肼，又稱聯(lián)氨NH2.NH2

在堿性環(huán)境中作用于胞嘧啶C和胸腺嘧啶T的C4和C6位置導致糖苷鍵斷裂。如果加入高濃度的鹽（1.5MNaCl），肼則主要作用于胞嘧啶C使之斷裂。在高溫強堿作用(90℃,1.2MNaOH)下可使腺嘌呤A位點發(fā)生劇烈的斷裂反應,但對胞嘧啶C的反應較弱胸腺嘧啶胞嘧啶Maxam-GilbertDNA化學降解法硫酸二甲酯[dimethylsulphate，DMS，（CH3O）2SO2]：

一種堿性化學試劑，可以使DNA鏈上的腺嘌呤A的N2和鳥嘌呤G的N７甲基化，但是鳥嘌呤G的N７甲基化速度比腺嘌呤A的N2甲基化速度要快4-10倍，并且在中性pH環(huán)境中，DMS主要作用于鳥嘌呤G，使之甲基化，導致糖苷鍵斷裂。哌啶甲酸(90℃,1mol/L)在修飾位點兩端使DNA的糖-磷酸鏈斷裂在4種反應體系中，化學試劑特異地斷裂DNA的機制是：G+A反應----（哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原子質子化，削弱了嘌呤脫氧核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。

G反應----硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后斷開了C8-C9間的化學鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結合。T+C反應----肼斷開了嘧啶環(huán)，產生堿基片段被哌啶置換。C反應----在NaCl存在時，只有C才能與肼發(fā)生反應，隨后，被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。Maxam-GilbertDNA化學降解法Maxam-GilbertDNA化學降解法5′—GATCACTACTG—3′標記5′—*GATCACTACTG—3′G：DMSC：肼（加鹽）G+A：甲酸C+T：肼5′-*GATCACTACTG5′-*G5′-*GATCACTACTG5′-*GATCACTA5′-*GATCA5′-*GA5′-*G5′-*GATCACTAC5′-*GATCACT5′-*GATCAC5′-*GATC5′-*GAT5′-*GATCACTACT5-*GATCACTACTG-5′-*GATCACTAC5′-*GATCAC5′-*GATC-*GATCACTACTG-Maxam-GilbertDNA化學降解法在化學修飾反應過程中，通過控制反應溫度和反應時間，只有一小部分堿基被修飾(而不是全部被修飾)，隨后進行的斷裂反應也是定量反應。因此，DNA鏈并不是在所有可被修飾的堿基位點斷裂，而是隨機斷裂。在4個反應中，產生4套帶相同標記末端、長短不一的寡聚核苷酸片段。只有帶標記末端的片段可被識別，沒有標記末端的片段可以忽略不計。Maxam-GilbertDNA化學降解法Maxam-GilbertDNA化學降解法Maxam-GilbertDNA化學降解法如果G+A中出現(xiàn)1條帶就看G列中是否有同樣大小的帶，若有即為G堿基，無則為A堿基；同理，C+T中則檢查C列中有無同樣大小條帶，有即為C，無則為T。Maxam-GilbertDNA化學降解法化學法測序采用32P標記DNA進行，條帶會較末端法更模糊，更寬，由于分辨率不足，從單塊凝膠上能得到可靠序列數(shù)量約為200-300bp以內。Maxam-GilbertDNA化學降解法優(yōu)點：不需要進行酶催化反應，因此不會產生由于酶催化反應而帶來的誤差；對未經克隆的DNA片段可以直接測序；化學降解測序法特別適用于測定含有如5-甲基腺嘌呤A或者G，C含量較高的DNA片段，以及短鏈的寡核苷酸片段的序列。

化學降解測序法既可以標記5'-末端，也可以標記3'-末端。如果從兩端分別測定同一條DNA鏈的核苷酸序列，相互參照測定結果，可以得到準確的DNA鏈序列。Maxam-GilbertDNA化學降解法缺點：

沒有改進,操作繁瑣,化學試劑的毒性大,放射性同位素標記效率偏低以致需要較長的放射自顯影曝光時間,人工讀取數(shù)據(jù)費時費力.

目前,僅在分析特殊DNA鏈的核苷酸序列和分析DNA和蛋白質相互作用中的DNA一級結構時才使用DNA測序在醫(yī)學中的應用在人類疾病基因研究的應用對遺傳病的預防和治療基因診斷基因治療DNA測序在醫(yī)學中的應用1986年由學者提出的，目前正在實施的人類基因組計劃(humangenomeproject)，則是要通過對人類基因組全序列的序列分析和人類基因的染色體圖譜制定達到了解其結構，認識其功能，即從分子遺傳學水平來認識人類自身的結構和功能特征的目的。