食品中金黃色葡萄球菌的快速檢測測試片法

1食品中金黃色葡萄球菌的快速檢測測試片法1范圍本文件規(guī)定了金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的快速檢測-測試片法。本文件適用于食品及加工環(huán)境涂抹樣品中金黃色葡萄球菌的快速檢驗和計數(shù)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB4789.10食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗金黃色葡萄球菌檢驗GB19489實驗室生物安全通用要求3設(shè)備和材料3.1電子天平:感量0.1g。3.2無菌均質(zhì)袋。3.3無菌均質(zhì)杯。3.4拍擊式均質(zhì)器。3.5振蕩器。3.6渦旋混合器。3.7恒溫培養(yǎng)箱:36℃±1℃。3.8無菌接種環(huán)(10μL)。3.9無菌錐形瓶:容量100mL、容量500mL。3.10pH計或精密pH試紙:精密度0.1。3.11無菌吸管:1mL(0.01mL刻度)、10mL(0.1mL刻度)或移液器及吸頭(0.1mL~1mL)。3.12無菌試管(18mm×180mm)。3.13高壓蒸汽滅菌器。4培養(yǎng)基和試劑4.1HandyPlate?金黃色葡萄球菌測試片。4.2無菌磷酸鹽緩沖液:見附錄A.1。4.3無菌生理鹽水:見附錄A.2。4.41mol/LNaOH溶液:見附錄A.3。4.51mol/LHCl溶液:見附錄A.4。4.6HandyPlate?金黃色葡萄球菌確認(rèn)反應(yīng)片。24.77.5%氯化鈉肉湯:見附錄A.5。4.8EHK?HK-N-PBS一次性采樣管。5檢驗程序金黃色葡萄球菌測試片法計數(shù)檢驗程序見圖1。y取1mL加入金黃色葡萄球菌測試片,yy圖1金黃色葡萄球菌測試片法計數(shù)檢驗程序金黃色葡萄球菌測試片法定性檢驗程序見圖2。y氯化鈉肉湯,均質(zhì)圖2金黃色葡萄球菌測試片法定性檢驗程序3yyyyyyy圖2金黃色葡萄球菌測試片法定性檢驗程序(續(xù))6計數(shù)操作步驟6.1樣品的稀釋6.1.1食品樣品:取25g樣品,加入含有225mL無菌稀釋液(無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液)的容量為500mL的無菌錐形瓶中,蓋好瓶塞,放置到振蕩器中振蕩2min;或放入無菌均質(zhì)袋中,加入225mL無菌稀釋液,用拍擊式均質(zhì)器高速拍打2min,制成1∶10樣品勻液。若樣品為液態(tài),吸取25mL樣品至盛有225mL無菌稀釋液(無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液)的容量為500mL的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中,振蕩混勻制成1∶10樣品勻液。樣品勻液的pH應(yīng)為6.5~7.5,pH過低或過高時可分別采用1moL/LNaOH溶液或1moL/LHCl溶液予以調(diào)節(jié)。含有較高活性酶(如面粉、香精香料)或較深顏色色素(如醬油、可樂等)的樣品,可加大稀釋液倍數(shù)(如1∶20)。6.1.2加工環(huán)境涂抹樣品:取1支HK-N-PBS一次性采樣管,取出拭子在食品加工接觸部位沿不銹鋼采樣板擦拭采樣表面(100cm2)從兩個方向(從左到右,然后從上到下)覆蓋整個區(qū)域。將拭子放回含緩沖液的采樣管中,渦旋混合以充分釋放微生物。6.1.3吸取1mL1∶10樣品稀釋液注入含有9mL無菌稀釋液的試管中,用渦旋混合器混勻,即為1∶100稀釋液。6.1.4按6.1.1.3操作程序制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次,更換一次無菌吸管或移液器吸頭。6.2接種培養(yǎng)6.2.1將測試片置于平坦表面處,揭開上膜。根據(jù)對樣品污染狀況的估計,選擇2個~3個連續(xù)適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),每個稀釋度分別吸取1mL樣品勻液于金黃色葡萄球菌測試片內(nèi),每組2個平行。靜置至少1min以使培養(yǎng)基凝固。同時分別取1mL無菌稀釋液加入金黃色葡萄球菌測試片作為空白對照,每組2個平行。6.2.2將測試片正面朝上,堆疊不超過20張,放入培養(yǎng)箱中,于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。6.2.3測試片培養(yǎng)結(jié)束后直接觀察,金黃色葡萄球菌可疑菌落為品紅至紫紅色菌落,其他菌為藍(lán)綠色、無色菌落。將可疑菌落用記號筆標(biāo)記。6.2.4揭開上膜,將確認(rèn)反應(yīng)片與培養(yǎng)基貼合,將上膜輕輕蓋下,用手輕輕滑動,趕走培養(yǎng)基區(qū)域內(nèi)的4氣泡,使確認(rèn)反應(yīng)片與上膜和下層凝膠完全貼合,于36℃±1℃培養(yǎng)4h~6h。6.2.5取出帶確認(rèn)反應(yīng)片的測試片,觀察標(biāo)記菌落的顏色。若標(biāo)記菌落變?yōu)樗{(lán)綠色、藍(lán)紫色,則判為金黃色葡萄球菌。若不變色,則為非金黃色葡萄球菌。6.2.6實驗室應(yīng)根據(jù)需要設(shè)置陽性對照、陰性對照,定期對檢驗過程進(jìn)行質(zhì)量控制。宜選用金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)FSCC(T)22301533或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽性對照菌株,表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)FSCC(T)22301925和大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)FSCC(T)149034505或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陰性對照菌株。7結(jié)果計算7.1選擇金黃色葡萄球菌菌落數(shù)為20CFU~200CFU的測試片計數(shù)金黃色葡萄球菌菌落總數(shù)。每個稀釋度取2個測試片的平均值,再乘以稀釋倍數(shù),作為樣品中金黃色葡萄球菌總數(shù)的結(jié)果。7.2若有2個連續(xù)稀釋度的測試片菌落數(shù)在合適范圍內(nèi),按公式(1)計算:………式中:N—樣品菌落數(shù);∑C—兩個連續(xù)稀釋度的所有測試片菌落數(shù)之和;n1—低稀釋倍數(shù)測試片個數(shù);n2—高稀釋倍數(shù)測試片個數(shù);d—低稀釋度稀釋因子。示例:稀釋度1∶100(低稀釋度)1∶1000(高稀釋度)菌落數(shù)/CFU132/12626/28數(shù)字修約后,表示為1.4×104。7.3若所有稀釋度測試片上的菌落數(shù)均小于20CFU,則按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。7.4若所有稀釋度測試片上的菌落數(shù)均大于200CFU,則按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。7.5若所有稀釋度的測試片菌落數(shù)均不在20CFU~200CFU,其中一部分小于20CFU或大于200CFU,則以接近20CFU或200CFU的平均菌落數(shù)乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)計算。7.6若所有稀釋度的測試片均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。7.7若所有稀釋度的測試片菌落數(shù)多不可計,則需重復(fù)實驗,選取更高稀釋度的樣品稀釋液計數(shù)。8報告根據(jù)計數(shù)結(jié)果報告每g(mL)樣品中金黃色葡萄球菌數(shù),以CFU/g(mL)表示。根據(jù)計數(shù)結(jié)果報告每100cm2加工環(huán)境涂抹樣品中金黃色葡萄球菌數(shù),以CFU/100cm2表示。59定性檢驗操作步驟9.1樣品處理9.1.1食品樣品:若樣品為固態(tài)或半固態(tài),無菌操作稱取25g樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min~2min或放入盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯的無菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min。若樣品為液態(tài),吸取25mL樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中,振蕩混勻1min~2min。樣品勻液的pH應(yīng)為6.5~7.5,pH過低或過高時可分別采用1moL/LNaOH溶液或1moL/LHCl溶液予以調(diào)節(jié)。9.1.2加工環(huán)境涂抹樣品:取1支HK-N-PBS一次性采樣管,取出拭子在食品加工接觸部位沿不銹鋼采樣板擦拭采樣表面(100cm2)從兩個方向(從左到右,然后從上到下)覆蓋整個區(qū)域。將拭子放回含緩沖液的采樣管中,渦旋混合以充分釋放微生物。將采樣管中的10mL緩沖液置于盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯的無菌均質(zhì)袋(或其他合適容器)中,用均質(zhì)器均質(zhì)1min~2min,充分混勻。9.2增菌將上述樣品勻液于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈渾濁生長。9.3接種培養(yǎng)9.3.1將測試片置于平坦表面處,揭開上膜。使用10μL接種環(huán)取一環(huán)混勻后的增菌液在測試片上劃線。用無菌吸管或移液器吸取1mL無菌生理鹽水于測試片內(nèi)。靜置至少1min以使培養(yǎng)基凝固。9.3.2將測試片正面朝上,堆疊不超過20張,放入培養(yǎng)箱中,于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。9.3.3觀察測試片上生長的菌落,金黃色葡萄球菌典型菌落為品紅至紫紅色菌落,其他的藍(lán)綠色、無色、棕黑色等均為非金黃色葡萄球菌。將可疑菌落用記號筆標(biāo)記。9.3.4揭開上膜,將確認(rèn)反應(yīng)片與培養(yǎng)基貼合,將上膜輕輕蓋下,用手輕輕滑動,趕走培養(yǎng)基區(qū)域內(nèi)的氣泡,使確認(rèn)反應(yīng)片與上膜和下層凝膠完全貼合,于36℃±1℃培養(yǎng)4h~6h。9.3.5取出帶確認(rèn)反應(yīng)片的測試片,觀察標(biāo)記菌落的顏色。若標(biāo)記菌落變?yōu)樗{(lán)綠色、藍(lán)紫色,則判為金黃色葡萄球菌。若不變色,則判為非金黃色葡萄球菌。9.3.6同6.2.6。10結(jié)果與報告根據(jù)測試片、確認(rèn)反應(yīng)片的結(jié)果報告:在25g(mL)樣品、100cm2加工環(huán)境涂抹樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。11廢棄物處置檢測過程中產(chǎn)生的廢棄物按照GB19489的相關(guān)要求進(jìn)行處置,含微生物的廢棄物應(yīng)121℃高壓蒸汽滅菌30min后再按相關(guān)規(guī)定處置。6(規(guī)范性)培養(yǎng)基和試劑A.1無菌磷酸鹽緩沖液A.1.1成分A.1.1.1磷酸二氫鉀A.1.1.2蒸餾水A.1.2制法34.0g500mLA.1.2.1貯存液:稱取34.0g磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中,用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2±0.1,用蒸餾水稀釋至1000mL后貯存于冰箱。A.1.2.2稀釋液:取貯存液1.25mL,用蒸餾水稀釋至1000mL,分裝于適宜容器中,121℃高壓蒸汽滅菌15min。A.2無菌生理鹽水A.2.1成分A.2.1.1氯化鈉A.2.1.2蒸餾水B.2.2制法8.5g1000mL稱取8.5g氯化鈉加入1000mL蒸餾水中,攪拌至完全溶解,分裝后,121℃高壓蒸汽滅菌15min,備用。A.31mol/LNaOH溶液A.3.1成分A.3.1.1NaOH40.0gA.3.1.2無菌蒸餾水1000mLA.3.2制法稱取40.0gNaOH溶于1000mL無菌蒸餾水中。A.41mol/LHCl溶液A.4.1成分A.4.1.1HCl90mLA.4.1.2無菌蒸餾水1000mLA.4.2制法移取濃鹽酸90