β-胡蘿卜素生物合成及高產(chǎn)菌株選育研究進(jìn)展

β-胡蘿卜素生物合成及高產(chǎn)菌株選育研究進(jìn)展β-胡蘿卜素生物合成及高產(chǎn)菌株選育研究進(jìn)展/β-胡蘿卜素生物合成及高產(chǎn)菌株選育研究進(jìn)展JIANGXIAGRICULTURALUNIVERSITY課程論文（設(shè)計(jì)）題目：β－胡蘿卜素生物合成及高產(chǎn)菌株選育研究進(jìn)展學(xué)院：生物科學(xué)及工程學(xué)院姓名：學(xué)號(hào)：專(zhuān)業(yè)：指導(dǎo)教師：二0一七年七月β－胡蘿卜素生物合成及高產(chǎn)菌株選育研究進(jìn)展早在19世紀(jì)30年代，化學(xué)家Wachenrooder就從胡蘿卜根中分離得出一種物質(zhì)，并以“胡蘿卜素”命名。此后隨著生化科技的發(fā)展，又分離出一系列的天然色素，命名為“類(lèi)胡蘿卜素”。類(lèi)胡蘿卜素是一類(lèi)重要的天然色素的總稱(chēng)，普遍存在于藻類(lèi)、真菌、動(dòng)物和高等植物中的紅色、橙紅色或黃色的色素之中ADDINNE.Ref.{2C52E89F-9E2D-4516-8527-8ACDC8C737C5}[1]，性質(zhì)非常的不穩(wěn)定，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)光、受熱、遇氧均易受到破壞。到目前為止，被發(fā)現(xiàn)的天然類(lèi)胡蘿卜素已經(jīng)高達(dá)600多種ADDINNE.Ref.{D7A4D44C-89C4-41AA-AD38-43A8C74509DB}[2,3]，類(lèi)胡蘿卜素主要存在以下幾類(lèi)：a-胡蘿卜素(a--Carotene)、β-胡蘿卜素(β-Carotene)、Y-胡蘿卜素(y-Carotene)和番茄紅素(Lycopene)ADDINNE.Ref.{2107B6FD-8232-4ABA-BD29-12B068372AB1}[4]。通過(guò)多數(shù)研究表明，β-胡蘿卜素物質(zhì)主要存在于天然的果蔬當(dāng)中ADDINNE.Ref.{B511E767-3CB2-4481-A720-83E27A644E8E}[5,6]，且具有較強(qiáng)抗氧化性ADDINNE.Ref.{C7A97160-4EB3-4357-922B-DE419F8A0D9B}[7]，能夠預(yù)防和并且治愈糖尿病ADDINNE.Ref.{7790ED0F-A8BC-43AF-B871-A4518114B91C}[8]，降低心血管疾病發(fā)病率ADDINNE.Ref.{98EE1F8D-C67C-46D4-B729-F365DBEDC968}[9]，具有抗癌和保護(hù)視力ADDINNE.Ref.{819E4078-CBF1-47FC-9E78-00ACEB27B0F4}[10]等多種生理功能。在天然環(huán)境條件下β-胡蘿卜素是所有動(dòng)物體內(nèi)維生素A的主要來(lái)源，大概有10%的類(lèi)胡蘿卜素（最主要是α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素）被作為維生素A的前體利用，其中以β-胡蘿卜素為前體的維生素A的原活性最高ADDINNE.Ref.{4046B40E-DC67-46BD-939A-4A5B38E045B5}[11,12]，這主要是由于β-胡蘿卜素具有的對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，1分子β-胡蘿卜素可以生成2分子的維生素AADDINNE.Ref.{99D652E9-0AE3-4D32-9031-D86BF3D5C6F5}[11]。β-胡蘿卜素（C40H56）作為類(lèi)胡蘿卜素的一種，也是橘黃色的脂溶性化合物，它是自然界中最廣泛存在也是最為穩(wěn)定的天然色素。隨著人們對(duì)健康意識(shí)的加強(qiáng)，對(duì)天然β-胡蘿卜素的需求量極大增加，開(kāi)發(fā)以及利用β-胡蘿卜素已經(jīng)成為一個(gè)全球矚目的發(fā)展態(tài)勢(shì)ADDINNE.Ref.{A3C26F37-D4F5-4112-8233-799927B32F3E}[13]。1國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)現(xiàn)狀對(duì)比β-胡蘿卜素作為一種天然的色素，類(lèi)屬于四萜類(lèi)化合物。有極其高的營(yíng)養(yǎng)學(xué)和藥物學(xué)價(jià)值，現(xiàn)如今已被化妝品、醫(yī)藥、食品添加劑保健品等行業(yè)廣泛應(yīng)用ADDINNE.Ref.{0C206F65-DC03-493B-8204-9137C3749B16}[14]。正是基于這些價(jià)值，讓?duì)?胡蘿卜素成為了國(guó)際社會(huì)上公認(rèn)的一種優(yōu)質(zhì)天然色素，同時(shí)也是維生素A的前體。因此，β-胡蘿卜素也已然成為了具有維生素A的原活性和良好著色雙重功能的化學(xué)物質(zhì)。隨著人類(lèi)的保健意識(shí)的增強(qiáng)和生活水平的提高，各式各樣營(yíng)養(yǎng)的食品添加劑的應(yīng)用生產(chǎn)也逐步受到重視，而β-胡蘿卜素就是其中的一種ADDINNE.Ref.{ADDAC554-4F5D-4048-9146-BDFFC2E7BDAD}[15]。β-胡蘿卜素作為一種脂溶性色素，其自身的顏色由于脂類(lèi)濃度的差異而會(huì)有所不同，顏色可包含由紅色到黃色的所有色系，受到食品行業(yè)強(qiáng)烈的歡迎。β-胡蘿卜素非常適合蛋白質(zhì)性產(chǎn)品及油性產(chǎn)品的研發(fā)，比如說(shuō)：素食產(chǎn)品、人造魚(yú)漿煉制品、奶油、速食面的調(diào)色、膠囊等ADDINNE.Ref.{75C6CFD9-D3F4-447F-AB40-306633114BDF}[16]。通過(guò)微膠囊處理的β-胡蘿卜素，能夠轉(zhuǎn)化成為水溶性的色素，可以應(yīng)用幾乎所有的食品。β-胡蘿卜素在化妝品行業(yè)同樣也有重大的用途，國(guó)內(nèi)外近些年來(lái)已將天然β-胡蘿卜素作為直接成分用于胭脂和口紅等化妝品中。作為一種飼料添加劑，適量濃度的β-胡蘿卜素能明顯提高雞鴨等家禽的產(chǎn)蛋率和蛋的孵化率，明顯提高豬、牛初生的窩仔數(shù)，明顯加深加深禽蛋的顏色，增強(qiáng)蝦和蛙魚(yú)的色質(zhì)。隨著人類(lèi)對(duì)β-胡蘿卜素生理功能的進(jìn)一步探索研究和深入，發(fā)現(xiàn)其在臨床上的醫(yī)療應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。目前在臨床上的醫(yī)療應(yīng)用普遍有：防治冠心病、老年疾病，及預(yù)防心腦血管硬化、腫瘤，治療白內(nèi)障和夜盲癥、治療干眼病和呼吸道炎癥、治療胃潰瘍和萎縮性胃炎、治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍、治療瘢痕疙瘩、治療矽肺病，對(duì)抗放射治療的某些副作用。在增強(qiáng)腫瘤放療療效方面有：治療紅細(xì)胞生成性原卟啉癥光敏性疾病ADDINNE.Ref.{9CF4BF37-3DB9-4412-B86B-CEEB3D440562}[17]。我國(guó)β-胡蘿卜素的生產(chǎn)主要還是從富含β-胡蘿卜素的植物當(dāng)中提取，由鹽藻培養(yǎng)，生物發(fā)酵法以及合成法4種方法。其中植物提取法主要還是因?yàn)樵仙a(chǎn)成本過(guò)高，當(dāng)中所含有的有效成分含量太低，從而影響其產(chǎn)業(yè)化。在80年代中期，上海第六制藥廠用維生素A作為原料，用化學(xué)法配制的β-胡蘿卜素已經(jīng)研究成功，并且大量投人生產(chǎn)，其生產(chǎn)容量大約為1t/a。在80年代末期，中國(guó)輕工業(yè)部制鹽研究所已經(jīng)從塘沽鹽場(chǎng)的鹽藻中成功地提取出了β-胡蘿卜素，并且在內(nèi)蒙古的吉蘭泰鹽湖區(qū)建成了約12萬(wàn)m2擴(kuò)鹽藻養(yǎng)殖地和5Okg/aβ-胡蘿卜素提取加工車(chē)間。2000年，武漢星辰現(xiàn)代生物工程有限公司開(kāi)始自行生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素。由武漢星辰生物工程有限公司、江蘇省微生物所和武漢病毒所共同完成的“2t/a發(fā)酵法生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素”課題項(xiàng)目于2001年已經(jīng)完成鑒定，其技術(shù)在國(guó)際社會(huì)上處于領(lǐng)先的地位。目前，上?；ぱ芯吭骸⑸虾９I(yè)微生物所、上海化工研究院、江蘇微生物研究所和中科院武漢病毒所的發(fā)酵法生產(chǎn)β-胡蘿卜素技術(shù)已經(jīng)十分成熟，可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的生產(chǎn)。至今為止，全球的β-胡蘿卜素的年需求量是1200-1500t/a，其中的95%是對(duì)天然產(chǎn)品的需求，年產(chǎn)量約600t，年銷(xiāo)售額為2億-2.5億美元左右，且每年以7%-9%的速率遞增。2000年我國(guó)的β-胡蘿卜素產(chǎn)量為10t。2001年的生產(chǎn)容量已經(jīng)達(dá)到了22t，生產(chǎn)的公司有4家,其中以發(fā)酵法生產(chǎn)的企業(yè)占了73%。我國(guó)β-胡蘿卜素執(zhí)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是FAO/WHo（1984）。隨著分析技術(shù)和毒理學(xué)的不斷發(fā)展，通過(guò)大量研究表明，盡管用化學(xué)的方法合成β-胡蘿卜素的生產(chǎn)成本低，純度相對(duì)較高，但它的缺點(diǎn)就是某些胡蘿卜素合成技術(shù)路線過(guò)于復(fù)雜，而且在某些合成的產(chǎn)品中，少量的化學(xué)成分有劇毒，能夠?qū)е氯旧w發(fā)生畸變，讓人致癌。而天然的β-胡蘿卜素則有很好的抗染色體畸變的作用，能夠有效地預(yù)防癌變。所以，天然的β-胡蘿卜素必將在未來(lái)的β-胡蘿卜素市場(chǎng)中的占主導(dǎo)的地位[18]ADDINNE.Ref.{025AAEF5-FE96-4641-903A-C737C43A5C50}。2β-胡蘿卜素研究進(jìn)展2.1β-胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)β-胡蘿卜素(β-carotene)，別名叫做葉紅素，它是一種天然的類(lèi)胡蘿卜素，廣泛存在于黃色和紅色的花朵、根莖、海藻、水果和蔬菜當(dāng)中，類(lèi)屬于四萜類(lèi)碳?xì)浠衔?，是?lèi)胡蘿卜素家族成員中極其重要的一位。它的分子式為C40H55，摩爾質(zhì)量為536.88，其結(jié)構(gòu)是由中心骨架即單雙鍵相間的長(zhǎng)多烯碳原子，通過(guò)兩端環(huán)化衍生出來(lái)的，其分子中含有4個(gè)異戊二烯側(cè)鏈和2個(gè)β-紫羅酮環(huán)，整個(gè)的分子構(gòu)象是對(duì)稱(chēng)的，也就是說(shuō)兩個(gè)β-紫羅酮環(huán)在兩端，其中心斷裂可以產(chǎn)生兩個(gè)維生素A分子，有多個(gè)雙鍵而且雙鍵之間共軛。理論上一分子的β-胡蘿卜素可以轉(zhuǎn)化生成兩分子的維生素A，故β-胡蘿卜素又被稱(chēng)之為維生素A原。β-胡蘿卜素是一種橘黃色的脂溶性化合物，隸屬于類(lèi)胡蘿素，能夠溶于苯、植物油、氯仿、石油醚和丙酮，不溶于丙三醇、甘油和水，難溶于乙醇和甲醇。β-胡蘿卜素是一種由11個(gè)共軛雙鍵組成的多烯體，結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)視黃基團(tuán)ADDINNE.Ref.{796F4185-2D9E-4794-B8FC-DBA89F68BF39}[19,20]。β-紫羅酮可能以異構(gòu)型、取代型、開(kāi)環(huán)型的形式存在。天然β-胡蘿卜素主要存在全反式、9-順式、13-順式及15-順式四種形式ADDINNE.Ref.{280ACE0D-62DC-4190-9005-541373E45E36}[21]。其結(jié)構(gòu)式如下圖：圖一β-胡蘿卜素結(jié)構(gòu)2.2β-胡蘿卜素的理化性質(zhì)β-胡蘿卜素是一種顏色為深紅色至暗紅色，有光澤的斜方六面體或者結(jié)晶性粉末，無(wú)臭無(wú)味，稀溶液呈現(xiàn)橙黃色到黃色，濃度增大時(shí)則表現(xiàn)為橙色，因溶劑極性不同可能稍帶紅色，濃度極低時(shí)呈現(xiàn)為黃色，熔點(diǎn)為176℃-184℃?；瘜W(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，遇到光線、熱和氧氣不穩(wěn)定，容易在光照和加熱時(shí)產(chǎn)生氧化反應(yīng)，在弱堿的情況下比較穩(wěn)定。因?yàn)樗姆肿咏Y(jié)構(gòu)中不存在不對(duì)稱(chēng)的手性碳原子，所以不具備旋光性。β-胡蘿卜素容易溶于許多的有機(jī)溶劑，比如說(shuō)：己烷、石油醚、甲苯、氯仿、四氯化碳、苯和二氯化碳，微溶于植物油，幾乎不溶于甘油、丙二醇、乙醇、甲醇和水。2.2β-胡蘿卜素的生理功能因?yàn)棣?胡蘿卜素特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，所以它具有一些及健康有關(guān)的性質(zhì)。β-胡蘿卜素是維生素A的前體物質(zhì)，而維生素A是一種極為重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不但在視力和預(yù)防夜盲癥的方面起到了至關(guān)重要的作用，而且對(duì)于機(jī)體的正常免疫功能、生長(zhǎng)、發(fā)展和胃腸道功能都有非常重要的影響。人體本身不能合成維生素A，因而，必須通過(guò)飲食等得到適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充。β-胡蘿卜素是當(dāng)前補(bǔ)充維生素A的最為安全的產(chǎn)品，其大體上主要還是存在于橙色、黃色和深綠色的水果(菠菜、兩紅柿、胡蘿卜、芒果)和蔬菜當(dāng)中ADDINNE.Ref.{D350B05D-6FBF-482F-BF15-E0C3D959F14D}[22-25]。且越是顏色鮮艷的水果或蔬菜，β-胡蘿卜素的含量就越高。β-胡蘿卜素具有很好的抗氧化功能，是-種常用的抗氧化劑ADDINNE.Ref.{52FD905B-D73E-4FDD-B0BA-019A4A43925F}[26,27]。β-胡蘿卜素具有很好解毒療效和良好的單線態(tài)氧的淸除性能，是維護(hù)人體健康必不可少的營(yíng)養(yǎng)元素，可以防止體內(nèi)自由基的攻擊，預(yù)防心血管疾病、白內(nèi)障和癌癥以及因細(xì)胞老化和衰亡而引起的各種相關(guān)疾病，并且β-胡蘿卜素作為維生素A原可以有效防止因?yàn)榫S生素A的缺乏所引起夜盲癥，并且可以促進(jìn)人體上皮細(xì)胞的正常成熟，同時(shí)也是理想的營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑和食品著色劑。2.3β-胡蘿卜素的合成β-胡蘿卜素的合成方法主要有4個(gè)種：化學(xué)合成、植物提取、基因工程以及微物發(fā)酵法生產(chǎn)β-胡蘿卜素。2.3.1植物法提取β-胡蘿卜素至今為止，常見(jiàn)的萃取方法ADDINNE.Ref.{0B3CE555-DB77-48E6-9973-DB08348FD9A7}[28]主要包括：鹽藻提取法、超臨界流體C〇2萃取法以及有機(jī)溶劑萃取法?？墒?，天然的植物當(dāng)中含有的代謝物水平通常比較低，及此同時(shí)萃取的工藝也相對(duì)復(fù)雜，導(dǎo)致β-胡蘿卜素的產(chǎn)率通常很低。而且，由于植物的生長(zhǎng)周期比較長(zhǎng)，受到地理生長(zhǎng)環(huán)境等諸多條件的限制。綜合比較考慮，利用植物法提取β-胡蘿卜素生產(chǎn)成本比較高，不適合企業(yè)的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)ADDINNE.Ref.{C4F881E0-5F8C-4197-8448-0DEFFA05E1E0}[29]。2.3.2化學(xué)法合成β-胡蘿卜素現(xiàn)如今90%的β-胡蘿卜素都是通過(guò)化學(xué)合成的手段生產(chǎn)。用化學(xué)法生產(chǎn)β-胡蘿卜素，生產(chǎn)成本很低，合成的工藝也較為純熟，是目前為止合成β-胡蘿卜素最主要的方法。但是，由于化合物結(jié)構(gòu)的手性及復(fù)雜的程度，利化學(xué)方法合成β-胡蘿卜素存在一定的局限性，因此阻礙了這種生產(chǎn)方法的繼續(xù)發(fā)展，且在生產(chǎn)的過(guò)程當(dāng)中，也有可能在產(chǎn)品當(dāng)中殘留一些有害的化學(xué)成分，對(duì)人體造成一定程度的損傷ADDINNE.Ref.{7AB65C56-DAA2-4CEB-8CF5-6130FFE7FA9C}[30]。2.3.3微生物發(fā)酵法生產(chǎn)β-胡蘿卜素微生物發(fā)酵法是指利用天然的、具備β-胡蘿卜素合成能力的微生物，如杜氏鹽藻、布拉克須霉和三孢布拉氏霉等ADDINNE.Ref.{D578C680-6179-49BB-85D0-2026DD832ECF}[31]，通過(guò)對(duì)微生物進(jìn)行定向培養(yǎng)，使其合成目標(biāo)產(chǎn)物β-胡蘿卜素，然后通過(guò)分離、細(xì)胞破碎、萃取等手段得到β-胡蘿卜素。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)的β-胡蘿卜素具有無(wú)毒、純天然等特點(diǎn)ADDINNE.Ref.{896EBF05-7726-423A-A59D-C188A97C40F1}[32]，而且相比較于化學(xué)合成法生產(chǎn)的β-胡蘿卜素而言，其更具有更良好的生物活性，因此，更加地受到廣大消費(fèi)者的青睞。但是，自然界中天然具備生產(chǎn)合成β-胡蘿卜素的微生物種類(lèi)少之又少，而且大多為具有致密的菌絲狀結(jié)構(gòu)的絲狀真菌，不容易進(jìn)行培養(yǎng)，這為微生物發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素大大的增加了難度。2.3.4基因工程法生產(chǎn)β-胡蘿卜素利用基因工程法生產(chǎn)β-胡蘿卜素是指利用分子生物學(xué)的手段將合成的β-胡蘿卜素基因?qū)氲竭x定的宿主細(xì)胞中構(gòu)建基因工程菌，使得其能夠合成β-胡蘿卜素。利用基因工程的手段能夠選擇遺傳背景較為清晰、易于基因操作、便于培養(yǎng)的宿主細(xì)胞進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。釀酒酵母和大腸桿菌分別作為真核生物和原核生物常用的模式生物，用于代謝通路的構(gòu)建。這兩種生物都具有遺傳背景清晰，便于基因操作的優(yōu)勢(shì)。相對(duì)于大腸桿菌而言，釀酒酵母具有額外的優(yōu)勢(shì)。利用微生物重新構(gòu)建生物合成途徑生產(chǎn)高價(jià)值的化合物越來(lái)越受到關(guān)注，目前，利用基因工程菌生產(chǎn)β-胡蘿卜素已經(jīng)成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。3育種方案3.1β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌株的誘變選育3.1.1出發(fā)菌株三孢布拉霉(Blakesleatrispora)CCTCC(＋)(－)菌。3.1.2培養(yǎng)基（1）斜面培養(yǎng)基土豆20%、葡萄糖2%、KH2PO40.05%、酵母浸粉0.1%、瓊脂2%，pH值6.5~7.2（121℃滅菌20min）。（2）種子培養(yǎng)基玉米淀粉3.5%、黃豆餅粉2.3%、KH2PO40.15%、MgSO4.7H2O0.01%、豆油0.5%、工業(yè)玉米漿1%、pH值自然，500ml三角瓶裝100ml(121℃滅菌20min)。（3）發(fā)酵培養(yǎng)基玉米淀粉3.0%、黃豆餅粉2.4%、KH2PO40.25%、MgSO4.7H2O0.02%、豆油3.5%、工業(yè)玉米漿2.0%、VB10.005%、檸檬酸三鈉0.3%，pH值7.0（121℃滅菌20min）。3.1.3誘變方法3.1.4單孢子懸液的制備三孢布拉霉接種于4°麥汁平板，25℃培養(yǎng)6-7天，使孢子成熟，從孢子囊中散出。采用分散法制備菌懸液，用鑷子將平板上的菌絲連孢子一起取出放于裝有玻璃珠和添加0.05%乳化劑OP的生理鹽水的三角瓶中充分振蕩后過(guò)濾，即制成菌懸液，視顏色深淺作一定稀釋?zhuān)刂奇咦訚舛?06個(gè)/mL左右。3.1.5誘變處理在黑暗條件下進(jìn)行紫外線照射，先預(yù)熱約30min，取5mL制備好的單孢子懸液置一直徑為6cm的培養(yǎng)皿中，將其放置在離紫外燈30cm（垂直距離）處的磁力攪拌器上，分別照射2，4，6，8，10，12min。將照射后的孢子懸液暗培養(yǎng)4h后，作一定的梯度稀釋?zhuān)缓蠓謩e涂布于麥汁平板上，于27℃暗培養(yǎng)待長(zhǎng)出單個(gè)菌落計(jì)數(shù)。取未經(jīng)紫外線處理的菌懸液稀釋涂于麥汁平板上作為對(duì)照。3.1.6誘變劑及誘變劑量的選擇紫外線是一種使用方便且誘變效果較好的物理誘變劑，其生物學(xué)效應(yīng)主要是由于它能引起DNA鏈的斷裂、DNA分子內(nèi)部和分子間的交聯(lián)、核酸及蛋白質(zhì)的交聯(lián)、嘧啶水合作用以及形成嘧啶二聚體，妨礙了堿基的正常配對(duì)，從而引起生物體的基因突變或死亡。采用不同時(shí)間的紫外線照射處理三孢布拉霉孢子，以照射時(shí)間為橫坐標(biāo)，致死率為縱坐標(biāo)，作紫外線的致死曲線。致死率（%）=（未經(jīng)處理的菌落數(shù)/mL-紫外照射后菌落數(shù)/mL）/(未經(jīng)處理的菌落數(shù)/mL)×100。一般認(rèn)為照射的劑量致死率控制在70%-80%時(shí)誘變效果好，并且有研究證明采用紫外線照射劑量為8min(致死率為81%)ADDINNE.Ref.{71658B08-5A75-4538-A8DD-C0898EB33BAF}[21]。3.1.7突變株的選育3.1.7.1初篩篩選培養(yǎng)基1：麥汁5°，瓊脂2.5%，β-紫羅酮（事先用少量乙醇溶解）；篩選培養(yǎng)基2：麥汁5°，玉米漿粉0.1%，瓊脂2.5%，洛伐他??；篩選培養(yǎng)基3：麥汁5°，玉米漿粉0.1%，瓊脂2.5%，二苯胺（事先用少量乙醇溶解，乙醇在培養(yǎng)基中的終濃度不得超過(guò)0.4mg/mL）；將誘變后孢子分別涂布篩選平板1、2、3，將分離出顏色較黃，孢子較豐富的單菌落于斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，再分別接入種子培養(yǎng)基（100mL/500mL），27℃，180r/min培養(yǎng)44h，以15%（V/V）接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基（25mL/250mL），27℃、180r/min培養(yǎng)120h。測(cè)菌絲體中β-胡蘿卜素含量。3.1.7.2復(fù)篩挑選一定量的初篩最佳菌種，接于搖瓶進(jìn)行復(fù)篩，復(fù)篩條件及方法同初篩。3.1.7.3遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)將復(fù)篩得到的菌株連續(xù)傳代7次，每代均經(jīng)搖瓶發(fā)酵后測(cè)定β-胡蘿卜素含量，重復(fù)3次。3.2代謝工程改造釀酒酵母高產(chǎn)β-胡蘿卜素3.2.1生產(chǎn)菌種釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）3.2.2β-胡蘿卜素生物合成路徑的設(shè)計(jì)及優(yōu)化現(xiàn)在企業(yè)用于生產(chǎn)β-胡蘿卜素的微生物主要還是E.coli、S.cerevisiae等，在這些微生物當(dāng)中構(gòu)建β-胡蘿卜素合成途徑通常包括3個(gè)功能相對(duì)獨(dú)立的模塊：糖酵解模塊、前體物質(zhì)合成模塊和β-胡蘿卜素合成模塊。圖2β-胡蘿卜素生物合成途徑Fig.2β-carotenebiosynthesispathways.G3P:glyceraldehyde-3-phosphate;DXP:1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate;MEP:2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate;IPP:isopentenyldiphosphate;DMAPP:dimethylallyldiphosphate;FPP:farnesyldiphosphate;GGPP:geranylgeranyldiphosphate;HMG-CoA:3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzymeA;dxs:1-deoxyxylulose-5-phosphatesynthase;dxr:1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatereductoisomerase;ispD:4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-Derythritolkinase;ispE:4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-Derythritolsynthase;ispF:2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphatesynthase;ispG:1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl4-diphosphatesynthase;ispH:4-hydroxy-3-methylbut-2-enyldiphosphatereductase;idi:isopentenyldiphosphateisomerase;ispA:geranyltranstransferase;crtE:GGPPsynthase;crtB:phytoenesynthase;crtI:phytoenedesaturase;crtY:lycopenecyclase;atoB:acetoacetyl-CoAthiolase;mvaS:HMG-CoAsynthase;mvaA:HMG-CoAreductase;mvaK1:mevalonatekinase;mvaK2:phosphomevalonatekinase;mvaD:diphosphomevalonatedecarboxylase.(1)利用MEP途徑合成異戊二烯焦磷酸（IPP）大腸桿菌跟其他原核生物通過(guò)MEP途徑為β-胡蘿卜素的合成提供了前體物質(zhì)IPP。甘油和葡萄糖利用糖酵解（EMP）途徑產(chǎn)生甘油醛-3-磷酸（G3P）以及丙酮酸，它們?cè)?-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(Dxs)的作用下形成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)，再經(jīng)過(guò)一系列類(lèi)異戊二烯酶：4-焦磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶(IspE)、2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-2,4-環(huán)焦磷酸合成酶(IspF)、4-羥基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸還原酶(IspH)、1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸合成酶(IspG)、DXP還原異構(gòu)酶(Dxr)和4-焦磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇合成酶(IspD)，將DXP轉(zhuǎn)化為C5異戊二烯亞單位——二甲基丙烯焦磷酸（DMAPP）和IPP，這兩種物質(zhì)通過(guò)異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶(Idi)相互轉(zhuǎn)化。（2）利用MVA途徑合成IPP植物和真核生物的線粒體等通過(guò)利用MVA途徑提供前體物質(zhì)。MVA途徑通?？梢苑譃樯嫌魏拖掠蝺蓚€(gè)部分。上游途徑通過(guò)HMG-CoA還原酶(MvaA)、HMG-CoA合成酶(MvaS)和乙酰輔酶A硫解酶(AtoB)三種酶將三分子的乙酰輔酶A(Acetyl-CoA)轉(zhuǎn)化成為甲羥戊酸(MVA)；而下游途徑通過(guò)二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MvaD)、磷酸甲羥戊酸激酶(MvaK2)和甲羥戊酸激酶(MvaK1)3種酶通過(guò)MVA途徑轉(zhuǎn)化形成IPP。整個(gè)MVA途徑的起點(diǎn)開(kāi)始于細(xì)胞中豐富的乙酰CoA，而且可能比MEP途徑供應(yīng)的IPP效率更高，通過(guò)在E.coli中引入外源MVA途徑能夠有效避免細(xì)菌本身的反饋抑制，從而產(chǎn)生大量的異戊二烯化合物。（3）β-胡蘿卜素合成模塊并且優(yōu)化野生菌——三孢布拉氏霉菌、成團(tuán)泛菌以及歐文氏菌中都含有β-胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)基因：crtEYIB基因簇。通過(guò)利用基因工程技術(shù)將基因簇整合到模式生物的染色體上，從而實(shí)現(xiàn)由前體到β-胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化。FPP是其他類(lèi)異戊二烯分子和類(lèi)胡蘿卜素生物合成的共同分支點(diǎn)和前體物，由ispB編碼的八聚異戊二烯焦磷酸合成酶催化FPP形成泛醌，從理論上來(lái)說(shuō)，ispB基因的表達(dá)會(huì)將代謝流量更多地引向泛醌的合成方向，但結(jié)果令人吃驚的是，過(guò)表達(dá)ispB反而會(huì)導(dǎo)致β-胡蘿卜素合成產(chǎn)量的增加。由圖2當(dāng)中可以看出，過(guò)表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(Pps)來(lái)控制丙酮酸和G3P的代謝流平衡之后，都能夠明顯地提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。而且因?yàn)楸崾翘墙徒馔緩剑‥MP）重要產(chǎn)物，生物體內(nèi)的主要代謝物，參及了許多的生理代謝反應(yīng)，因此，如果要使代謝流盡可能多地流向β-胡蘿卜素合成方向，則必須要減少副產(chǎn)物，如：乙酸和乳酸的形成ADDINNE.Ref.{B254A5AC-BCFF-4319-984A-2429B9FB0B47}[33]。3.3基因工程改造釀酒酵母高產(chǎn)β-胡蘿卜素3.3.1質(zhì)粒載體的選擇一些質(zhì)粒DNA編碼的表型為基因工程提供了很好的選擇標(biāo)記。質(zhì)粒DNA可以通過(guò)人工轉(zhuǎn)化過(guò)程將其導(dǎo)入細(xì)菌之中。然而即使在最佳條件下，也只有少數(shù)細(xì)菌能夠穩(wěn)定地接受質(zhì)粒。而要鑒定哪些細(xì)菌細(xì)胞接受了轉(zhuǎn)化體，就需要利用質(zhì)粒編碼的可選擇標(biāo)記。這些標(biāo)記可產(chǎn)生一種新的表型，因此，可以把轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌挑選出來(lái)。由圖2可以得出，異戊二烯焦磷酸(IPP)作為β-胡蘿卜素的前體物質(zhì)，我們可以通過(guò)提高IPP的合成來(lái)提高β-胡蘿卜素含量。過(guò)表達(dá)類(lèi)異戊二烯關(guān)鍵基因如dxs和idi。Dxs和Idi被認(rèn)為是類(lèi)異戊二烯合成途徑的限速步驟，一般通過(guò)基因修飾來(lái)增加這兩個(gè)酶的活性；抑制競(jìng)爭(zhēng)路徑異戊二烯焦磷酸的利用，減弱或敲除旁路代謝過(guò)程。由于編碼GGPP合成酶的基因crtE具有序列多樣性，所以在β-胡蘿卜素合成結(jié)構(gòu)基因的起始處應(yīng)當(dāng)選擇一個(gè)較為有效的crtE基因。RNAi(RNAinterference)的出現(xiàn)，使生物合成途徑上某些基因如β-胡蘿卜素酮化酶、羥化酶基因沉默，阻斷β-胡蘿卜素的迚一步代謝，使之在細(xì)胞內(nèi)積累。ADDINNE.BibReferences:[1]. 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