王鏡巖生物化學（第三版）答案

朽木易折，金石可鏤。千里之行，始于足下。全文共頁-word可編輯生物化學（第三版）課后習題詳細解答第三章氨基酸提要α-氨基酸是蛋白質的構件分子，當用酸、堿或蛋白酶水解蛋白質時可獲得它們。蛋白質中的氨基酸都是L型的。但堿水解得到的氨基酸是D型和L型的消旋混合物。參加蛋白質組成的基本氨基酸惟獨20種。此外還有若干種氨基酸在某些蛋白質中存在，但它們都是在蛋白質生物合成后由相應是基本氨基酸（殘基）經化學修飾而成。除參加蛋白質組成的氨基酸外，還有無數種其他氨基酸存在與各種組織和細胞中，有的是β-、γ-或δ-氨基酸，有些是D型氨基酸。氨基酸是兩性電解質。當pH臨近1時，氨基酸的可解離基團所有質子化，當pH在13左右時，則所有去質子化。在這中間的某一pH（因不同氨基酸而異），氨基酸以等電的兼性離子（H3N+CHRCOO-）狀態(tài)存在。某一氨基酸處于凈電荷為零的兼性離子狀態(tài)時的介質pH稱為該氨基酸的等電點，用pI表示。所有的α-氨基酸都能與茚三酮發(fā)生色彩反應。α-NH2與2,4-二硝基氟苯（DNFB）作用產生相應的DNP-氨基酸（Sanger反應）；α-NH2與苯乙硫氰酸酯（PITC）作用形成相應氨基酸的苯胺基硫甲酰衍生物（Edman反應）。胱氨酸中的二硫鍵可用氧化劑（如過甲酸）或還原劑（如巰基乙醇）斷裂。半胱氨酸的SH基在空氣中氧化則成二硫鍵。這幾個反應在氨基酸荷蛋白質化學中占有重要地位。除甘氨酸外α-氨基酸的α-碳是一個手性碳原子，因此α-氨基酸具有光學活性。比旋是α-氨基酸的物理常數之一，它是鑒別各種氨基酸的一種按照。參加蛋白質組成的氨基酸中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸在紫外區(qū)有光吸收，這是紫外吸收法定量蛋白質的根據。核磁共振（NMR）波譜技術在氨基酸和蛋白質的化學表征方面起重要作用。氨基酸分析分離主意主要是基于氨基酸的酸堿性質和極性大小。常用主意有離子交換柱層析、高效液相層析（HPLC）等。習題1.寫出下列氨基酸的單字母和三字母的縮寫符號：精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰氨、谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。[見表3-1]表3-1氨基酸的簡寫符號名稱三字母符號單字母符號名稱三字母符號單字母符號丙氨酸(alanine)AlaA亮氨酸(leucine)LeuL精氨酸(arginine)ArgR賴氨酸(lysine)LysK天冬酰氨(asparagines)AsnN甲硫氨酸(蛋氨酸)(methionine)MetM天冬氨酸(asparticacid)AspD苯丙氨酸(phenylalanine)PheFAsn和/或AspAsxB半胱氨酸(cysteine)CysC脯氨酸(praline)ProP谷氨酰氨(glutamine)GlnQ絲氨酸(serine)SerS谷氨酸(glutamicacid)GluE蘇氨酸(threonine)ThrTGln和/或GluGlsZ甘氨酸(glycine)GlyG色氨酸(tryptophan)TrpW組氨酸(histidine)HisH酪氨酸(tyrosine)TyrY異亮氨酸(isoleucine)IleI纈氨酸(valine)ValV2、計算賴氨酸的εα-NH3+20%被解離時的溶液PH。[9.9]解：pH=pKa+lg20%pKa=10.53(見表3-3，P133)pH=10.53+lg20%=9.833、計算谷氨酸的γ-COOH三分之二被解離時的溶液pH。[4.6]解：pH=pKa+lg2/3%pKa=4.25pH=4.25+0.176=4.4264、計算下列物質0.3mol/L溶液的pH：(a)亮氨酸鹽酸鹽；(b)亮氨酸鈉鹽；(c)等電亮氨酸。[(a)約1.46,(b)約11.5,(c)約6.05]5、按照表3-3中氨基酸的pKa值，計算下列氨基酸的pI值：丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸和精氨酸。[pI:6.02;5.02;3.22;10.76]解：pI=1/2（pKa1+pKa2）pI(Ala)=1/2（2.34+9.69）=6.02pI(Cys)=1/2（1.71+10.78）=5.02pI(Glu)=1/2（2.19+4.25）=3.22pI(Ala)=1/2（9.04+12.48）=10.766、向1L1mol/L的處于等電點的甘氨酸溶液參加0.3molHCl，問所得溶液的pH是多少？倘若參加0.3molNaOH以代替HCl時，pH將是多少？[pH：2.71；9.23]7、將丙氨酸溶液（400ml）調節(jié)到pH8.0，然后向該溶液中參加過量的甲醛，當所得溶液用堿反滴定至Ph8.0時，消耗0.2mol/LNaOH溶液250ml。問起始溶液中丙氨酸的含量為多少克？[4.45g8、計算0.25mol/L的組氨酸溶液在pH6.4時各種離子形式的濃度（mol/L）。[His2+為1.78×10-4，His+為0.071，His0為2.8×10-4]9、說明用含一個結晶水的固體組氨酸鹽酸鹽（相對分子質量=209.6；咪唑基pKa=6.0）和1mol/LKOH配制1LpH6.5的0.2mol/L組氨酸鹽緩沖液的主意[取組氨酸鹽酸鹽41.92g(0.2mol)，參加352ml1mol/LKOH，用水稀釋至1L10、為什么氨基酸的茚三酮反映液能用測壓法定量氨基酸？解：茚三酮在弱酸性溶液中與α-氨基酸共熱，引起氨基酸氧化脫氨脫羧反映，（其反應化學式見P139），其中，定量釋放的CO2可用測壓法測量，從而計算出參加反應的氨基酸量。11、L-亮氨酸溶液（3.0g/50ml6mol/LHCl）在20cm旋光管中測得的旋光度為+1.81o。計算L-亮氨酸在6mol/LHCl中的比旋（[a]）。[[a]=+15.112、標出異亮氨酸的4個光學異構體的（R，S）構型名稱。[參考圖3-15]13、甘氨酸在溶劑A中的溶解度為在溶劑B中的4倍，苯丙氨酸在溶劑A中的溶解度為溶劑B中的兩倍。利用在溶劑A和B之間的逆流分溶主意將甘氨酸和苯丙氨酸分開。在起始溶液中甘氨酸含量為100mg，苯丙氨酸為81mg，試回答下列問題：(1)利用由4個分溶管組成的逆流分溶系統(tǒng)時，甘氨酸和苯丙氨酸各在哪一號分溶管中含量最高？（2）在這樣的管中每種氨基酸各為多少毫克？[（1）第4管和第3管；（2）51.2mgGly+24mgPhe和38.4mgGly+36mgPhe]解：按照逆流分溶原理，可得：對于Gly：Kd=CA/CB=4=q(動相)/p（靜相）p+q=1=(1/5+4/5)4個分溶管分溶3次：（1/5+4/5）3=1/125+2/125+48/125+64/125對于Phe：Kd=CA/CB=2=q(動相)/p（靜相）p+q=1=(1/3+2/3)4個分溶管分溶3次：（1/3+2/3）3=1/27+6/27+12/27+8/27故利用4個分溶管組成的分溶系統(tǒng)中，甘氨酸和苯丙氨酸各在4管和第3管中含量最高，其中：第4管：Gly：64/125×100=51.2mgPhe：8/27×81=24mg第3管：Gly：48/125×100=38.4mgPhe：12/27×81=36mg14、指出在正丁醇：醋酸：水的系統(tǒng)中舉行紙層析時，下列混合物中氨基酸的相對遷移率（假定水相的pH為4.5）：(1)Ile,Lys;(2)Phe,Ser(3)Ala,Val,Leu;(4)Pro,Val(5)Glu,Asp;(6)Tyr,Ala,Ser,His.[Ile>lys；Phe,>Ser；Leu>Val>Ala,；Val>Pro；Glu>Asp；Tyr>Ala>Ser≌His]解：按照P151圖3-25可得結果。15．將含有天冬氨酸(pI=2.98)、甘氨酸(pI=5.97)、亮氨酸(pI=6.53)和賴氨酸(pI=5.98)的檸檬酸緩沖液，加到預先同樣緩沖液平衡過的強陽離交換樹脂中，隨后用愛緩沖液析脫此柱，并分離收集洗出液，這5種氨基酸將按什么次序洗脫下來？[Asp,Thr,Gly,Leu,Lys]解：在pH3左右，氨基酸與陽離子交換樹脂之間的靜電吸引的大小次序是減刑氨基酸(A2+)>中性氨基酸(A+)>酸性氨基酸(A0)。因此氨基酸的洗出順序大體上是酸性氨基酸、中性氨基酸，最后是堿性氨基酸，因為氨基酸和樹脂之間還存在疏水互相作用，所以其洗脫順序為：Asp,Thr,Gly,Leu,Lys。第四章蛋白質的共價結構提要蛋白質分子是由一條或多條肽鏈構成的生物大分子。多肽鏈是由氨基酸通過肽鍵共價銜接而成的，各種多肽鏈都有自己特定的氨基酸序列。蛋白質的相對分子質量介于6000到或更高。蛋白質分為兩大類：單純蛋白質和綴合蛋白質。按照分子形狀可分為纖維狀蛋白質、球狀蛋白質和膜蛋白質。此外還可按蛋白質的生物學功能分類。為了表示蛋白質結構的不同組織層次，常常使用一級結構、二級結構、三級結構和四級結構這樣一些專門術語。一級結構就是共價主鏈的氨基酸序列，偶爾也稱化學結構。二、三和四級結構又稱空間結構（即三維結構）或高級結構。蛋白質的生物功能決定于它的高級結構，高級結構是由一級結構即氨基酸序列決定的，二氨基酸序列是由遺傳物質DNA的核苷酸序列規(guī)定的。肽鍵（CO—NH）是銜接多肽鏈主鏈中氨基酸殘破的共價鍵，二硫鍵是使多肽鏈之間交聯或使多肽鏈成環(huán)的共價鍵。多肽鏈或蛋白質當發(fā)生部分水解時，可形成長短不一的肽段。除部分水解可以產生小肽之外，生物界還存在許多游離的小肽，如谷胱甘肽等。小肽晶體的熔點都很高，這說明短肽的晶體是離子晶格、在水溶液中也是以偶極離子存在的。測定蛋白質一級結構的策略是：（1）測定蛋白質分子中多肽鏈數目；（2）拆分蛋白質分子的多肽鏈；（3）斷開多肽鏈內的二硫橋；（4）分析每一多肽鏈的氨基酸組成；（5）鑒定多肽鏈的N-末端和C-末端殘基；（6）斷裂多肽鏈成較小的肽段，并將它們分離開來；（7）測定各肽段的氨基酸序列；（8）利用重疊肽重建殘破多肽鏈的一級結構；（9）決定半胱氨酸殘基形成的S-S交聯橋的位置。序列分析中的重要主意和技術有：測定N-末端基的苯異硫氰酸酯（PITC）法，分析C-末端基的羧肽酶法，用于多肽鏈局部斷裂的酶裂解和CNBr化學裂解，斷裂二硫橋的巰基乙醇處理，測定肽段氨基酸序列的Edman化學降解和電噴射串聯質譜技術，重建多肽鏈一級序列的重疊肽拼湊法以及用于二硫橋定位的對角線電泳等。在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質稱同源蛋白質。同源蛋白質具有顯然的序列相似性(稱序列同源),兩個物種的同源蛋白質，其序列間的氨基酸差異數目與這些物種間的系統(tǒng)發(fā)生差異是成比例的。并按照同源蛋白質的氨基酸序列資料建立起進化樹。同源蛋白質具有共同的進化起源。在生物體內有些蛋白質常以前體形試合成，惟獨按一定方式裂解除去部分肽鏈之后才浮上生物活性，這一現象稱蛋白質的激活。血液凝結是涉及氨基酸序列斷裂的一系列酶原被激活的結果，酶促激活的級聯放大，使血凝塊疾馳形成成為可能。凝血酶原和血清蛋白原是兩個最重要的血凝因子。血纖蛋白蛋白原在凝血酶的作用下改變?yōu)檠宓鞍啄龎K（血塊的主要成分）。我國在20世紀60年代首次在世界上人工合成了蛋白質——結晶牛胰島素。近二、三十年發(fā)展起來的固相肽合成是控制合成技術上的一個龐大長進，它對分子生物學和基因工程也就具有重要影響和意義。至今利用Merrifield固相肽合成儀已勝利地合成了許多肽和蛋白質。習題1.倘若一個相對分子質量為12000的蛋白質，含10種氨基酸，并假設每種氨基酸在該蛋白質分子中的數目相等，問這種蛋白質有多少種可能的羅列順序？[10100]解：/120=101002、有一個A肽，經酸解分析得知為Lys、His、Asp、Glu2、Ala以及Val、Tyr驟然兩個NH3分子組成。當A肽與FDNB試劑反應后得DNP-Asp；當用羧肽酶處理后得游離纈氨酸。倘若我們在實驗中將A肽用胰蛋白酶降解時，得到兩種肽，其中一種（Lys、Asp、Glu、Ala、Tyr）在pH6.4時，凈電荷為零，另一種（His、Glu以及Val）可給除DNP-His，在pH6.4時，帶正電荷。此外，A肽用糜蛋白酶降解時，也得到兩種肽，其中一種（Asp、Ala、Tyr）在pH6.4時全中性，另一種（Lys、His、Glu2以及Val）在pH6.4時帶正電荷。問A肽的氨基酸序列如何？[Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val]解：1、N-末端分析：FDNB法得：Asp-；2、C-末端分析：羧肽酶法得：-Val；3、胰蛋白酶只斷裂賴氨酸或精氨酸殘基的羧基形成的肽鍵，得到的是以Arg和Lys為C-末端殘基的肽斷。酸水解使Asn→Asp+NH4+，由已知條件（Lys、Asp、Glu、Ala、Tyr）可得：Asn-()-()-()-Lys-()-()-Val；4、FDNB法分析N-末端得DNP-His，酸水解使Gln→Glu+NH4+由已知條件（His、Glu、Val）可得：Asn-()-()-()-Lys-His-Gln-Val；5、糜蛋白酶斷裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸殘基的羧基端肽鍵。由題，得到的一條肽（Asp、Ala、Tyr）結合（3）、（4）可得該肽的氨基酸序列為：Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val3、某多肽的氨基酸序列如下：Glu-Val-Lys-Asn-Cys-Phe-Arg-Trp-Asp-Leu-Gly-Ser-Leu-Glu-Ala-Thr-Cys-Arg-His-Met-Asp-Gln-Cys-Tyr-Pro-Gly-Glu_Glu-Lys。（1）如用胰蛋白酶處理，此多肽將產生幾個肽？并解釋緣故（假設沒有二硫鍵存在）；（2）在pH7.5時，此多肽的凈電荷是多少單位？說明理由（假設pKa值：α-COOH4.0；α-NH3+6.0；Glu和Asp側鏈基4.0；Lys和Arg側鏈基11.0；His側鏈基7.5；Cys側鏈基9.0；Tyr側鏈基11.0）；（3）如何判斷此多肽是否含有二硫鍵？倘若有二硫鍵存在，請設計實驗決定5，17和23位上的Cys哪兩個參加形成？[（1）4個肽；（2）-2.5單位；（3）倘若多肽中無二硫鍵存在，經胰蛋白酶水解后應得4個肽段；倘若存在一個二硫鍵應得3個肽段并且個肽段所帶電荷不同，因此可用離子交換層析、電泳等主意將肽段分開，鑒定出含二硫鍵的肽段，測定其氨基酸順序，便可決定二硫鍵的位置]4、今有一個七肽，經分析它的氨基酸組成是：Lys、Pro、Arg、Phe、Ala、Tyr和Ser。此肽未經糜蛋白酶處理時，與FDNB反應不產生α-DNP-氨基酸。經糜蛋白酶作用后，此肽斷裂城兩個肽段，其氨基酸組成分離為Ala、Tyr、Ser和Pro、Phe、Lys、Arg。這兩個肽段分離與FDNB反應，可分離產生DNP-Ser和DNP-Lys。此肽與胰蛋白酶反應能生成兩個肽段，它們的氨基酸組成分離是Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala。試問此七肽的一級結構怎樣？[它是一個環(huán)肽，序列為：-Phe-Ser-Ala-Tyr-Lys-Pro-Arg-]解：（1）此肽未經糜蛋白酶處理時，與FDNB反應不產生α-DNP-氨基酸，說明此肽不含游離末端NH2，即此肽為一環(huán)肽；（2）糜蛋白酶斷裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸殘基的羧基端肽鍵，由已知兩肽段氨基酸組成（Ala、Tyr、Ser和Pro、Phe、Lys、Arg）可得：-()-()-Tyr-和-()-()-()-Phe-；（3）由（2）得的兩肽段分離與FDNB反應，分離產生DNP-Ser和DNP-Lys可知該兩肽段的N-末端分離為-Ser-和-Lys-，結合（2）可得：-Ser-Ala-Tyr-和-Lys-()-()-Phe-；（4）胰蛋白酶專一斷裂Arg或Lys殘基的羧基參加形成的肽鍵，由題生成的兩肽段氨基酸組成（Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala）可得：-Pro-Arg-和-()-()-()-()-Lys；綜合（2）、（3）、（4）可得此肽一級結構為：-Lys-Pro-Arg-Phe-Ser-Ala-Tyr-5、三肽Lys-Lys-Lys的pI值必然大于它的任何一個個別基團的pKa值，這種說法是否準確？為什么？[準確，因為此三肽處于等電點時，七解離集團所處的狀態(tài)是C-末端COO-（pKa=3.0），N末端NH2（pKa≌8.0），3個側鏈3（1/3ε-NH3+）（pKa=10.53）(pKa=10.53),因此pI>最大的pKa值（10.53）]6、一個多肽可還原為兩個肽段，它們的序列如下：鏈1為Ala-Cys-Phe-Pro-Lys-Arg-Trp-Cys-Arg-Arg-Val-Cys；鏈2為Cys-Tyr-Cys-Phe-Cys。當用嗜熱菌蛋白酶消化原多肽（具有殘破的二硫鍵）時可用下列各肽：（1）（Ala、Cys2、Val）；（2）（Arg、Lys、Phe、Pro）；（3）(Arg2、Cys2、Trp、Tyr)；（4）(Cys2、Phe)。試指出在該天然多肽中二硫鍵的位置。（結構如下圖）S-SAla-Cys-Phe-Pro-Lys-Arg-Trp-Cys-Arg-Arg-Val_CysSSCys-Tyr-Cys-Phe-Cys解：嗜熱菌蛋白酶作用專一性較差，按照題中已知條件：（1）消化原多肽得到（Ala、Cys2、Val），說明鏈1在2位Cys后及11位Val前發(fā)生斷裂，2位Cys與12位Cys之間有二硫鍵；（2）由鏈1序列可得該肽段序列為：-Phe-Pro-Lys-Arg-；（3）由（1）（2）可知該肽段(Arg2、Cys2、Trp、Tyr)中必有一Cys來自鏈2，另一Cys為鏈1中8位Cys，即鏈1中8位Cys與鏈2中的一個Cys有二硫鍵；（4）嗜熱菌蛋白酶能水解Tyr、Phe等疏水氨基酸殘基，故此肽（Cys2、Phe）來自鏈2，結合（3）中含Tyr，可知（3）中形成的二硫鍵為鏈18位Cys與鏈2中3位Cys與鏈2中3位Cys之間；（4）中（Cys2、Phe）說明鏈2中1位Cys與5位Cys中有二硫鍵。綜合（1）、（2）、（3）、（4）可得結果。7、一個十肽的氨基酸分析表明其水解液中存在下列產物：NH4+AspGluTyrArgMetProLysSerPhe并看見下列事實：（1）用羧肽酶A和B處理該十肽無效；（2）胰蛋白酶處理產生兩各四肽和游離的Lys；（3）梭菌蛋白酶處理產生一個四肽和一個六肽；（4）溴化氫處理產生一個八肽和一個二肽，用單字母符號表示其序列位NP；（5）胰凝乳蛋白酶處理產生兩個三肽和一個四肽，N-末端的胰凝乳蛋白酶水解肽段在中性pH時攜帶-1凈電荷，在pH12時攜帶-3凈電荷；（6）一輪Edman降解給出下面的PTH衍生物：（圖略）寫出該十肽的氨基酸序列。[Ser-Glu-Tyr-Arg-Lys-Lys-Phe-Met-Asn-Pro]解：（1）用羧肽酶A和B處理十肽無效說明該十肽C-末端殘基為-Pro；（2）胰蛋白酶專一斷裂Lys或Arg殘基的羧基參加形成的肽鍵，該十肽在胰蛋白酶處理后產生了兩個四肽和有利的Lys，說明十肽中含Lys-…或-Arg-…-Lys-Lys-…或-Arg-Lys-…-Lys-…Arg-Lys-…四種可能的肽段，且水解位置在4與5、5與6或4與5、8與9、9與10之間；（3）梭菌蛋白酶專一裂解Arg殘基的羧基端肽鍵，處理該十肽后，產生一個四肽和一個六肽，則可知該十肽第四位為-Arg-；（4）溴化氰只斷裂由Met殘基的羧基參加形成的肽鍵，處理該十肽后產生一個八肽和一個二肽，說明該十肽第八位或第二位為-Met-；用單字母表示二肽為NP，即-Asn-Pro-，故該十肽第八位為-Met-；（5）胰凝乳蛋白酶斷裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸殘基的羧基端肽鍵，處理該十肽后，產生兩個三肽和一個四肽，說明該十肽第三位、第六位或第七位為Trp或Phe；（6）一輪Edman降解分析N-末端，按照其反應邏輯，可得N-末端氨基酸殘疾結構式為：-NH-CH(-CH2OH)-C(=O)-，還原為-NH-CH(-CH2OH)-COOH-，可知此為Ser；結合（1）、（2）、（3）、（4）、（5）、（6）可知該十肽的氨基酸序列為：Ser-Glu-Tyr-Arg-Lys-Lys-Phe-Met-Asn-Pro8、一個四肽，經胰蛋白酶水解得兩個片段，一個片段在280nm附近有強的光吸收，并且Pauly反應和坂口反應（檢測胍基的）呈陽性。另一片段用溴化氰處理釋放出一個與茚三酮反應呈黃色的氨基酸。寫出此四肽的氨基酸序列。[YRMP]解：胰蛋白酶酶專一水解Lys和Arg殘基的羧基參加形成的肽鍵，故該四肽中含Lys或Arg；一肽段在280nm附近有強光吸收且Pauly反應和坂口反應（檢測胍基的）呈陽性，說明該肽段含Tyr和Arg；溴化氰專一斷裂Met殘基的羧基參加形成的肽鍵，又因生成了與茚三酮反應呈黃色的氨基酸，故該肽段為-Met-Pro-；所以該四肽的氨基酸組成為Tyr-Arg-Met-Pro，即YRMP。9蜂毒明肽（apamin）是存在蜜蜂毒液中的一個十八肽，其序列為CNVRAPETALCARRCOOH，已知蜂毒明肽形成二硫鍵，不與碘乙酸發(fā)生反應，（1）問此肽中存在多少個二硫鍵？（2）請設計決定這些（個）二硫鍵位置的策略。[（1）兩個；（2）二硫鍵的位置可能是1-3和11-15或1-11和3-15或1-15和3-11，第一種情況，用胰蛋白酶斷裂將產生兩個肽加Arg；第二種情況和第三種，將產生一個肽加Arg，通過二硫鍵部分氧化可以把后兩種情況區(qū)別開來。]10、講述用Mernfield固相化學主意合成二肽Lys-Ala。倘若你決定向Lys-Ala參加一個亮氨酸殘基使成三肽，可能會掉進什么樣的“陷坑”？第五章蛋白質的三維結構提要每一種蛋白質至少都有一種構像在生理條件下是穩(wěn)定的，并具有生物活性，這種構像稱為蛋白質的天然構像。研究蛋白質構像的主要主意是X射線晶體結構分析。此外紫外差光譜、熒光和熒光偏振、圓二色性、核磁共振和重氫交換等被用于研究溶液中的蛋白質構像。穩(wěn)定蛋白質構像的作用有氫鍵、范德華力、疏水互相作用和離子鍵。此外二硫鍵在穩(wěn)定某些蛋白質的構像種也起重要作用。多肽鏈折疊成特定的構像受到空間上的許多限制。就其主鏈而言，因為肽鏈是由多個相鄰的肽平面構成的，主鏈上惟獨α-碳的二平面角Φ和Ψ能自由旋轉，但也受到很大限制。某些Φ和Ψ值是立體化學所允許的，其他值則不被允許。并因此提出了拉氏構像，它表明蛋白質主鏈構象在圖上所占的位置是很有限的（7.7%-20.3%）。蛋白質主鏈的折疊形成由氫鍵維系的重復性結構稱為二級結構。最常見的二級結構元件有α螺旋、β轉角等。α螺旋是蛋白質中最典型、含量最豐盛的二級結構。α螺旋結構中每個肽平面上的羰氧和酰氨氫都參加氫鍵的形成，因此這種構象是相當穩(wěn)定的。氫鍵大體上與螺旋軸平行，每圈螺旋占3.6個氨基酸殘基，每個殘基繞軸旋轉100°，螺距為0.54nm。α-角蛋白是毛、發(fā)、甲、蹄中的纖維狀蛋白質，它幾乎徹低由α螺旋構成的多肽鏈構成。β折疊片中肽鏈主鏈處于較舒展的蜿蜒（鋸齒）形式，肽鏈之偶爾一條肽鏈的肽段之間借助氫鍵彼此銜接成片狀結構，故稱為β折疊片，每條肽鏈或肽段稱為β折疊股或β股。肽鏈的走向可以有平行和反平行兩種形式。平行折疊片構象的舒展程度略小于反平行折疊片，它們的重復周期分離為0.65nm和0.70nm。大多數β折疊股和β折疊片都有右手扭曲的傾向，以緩解側鏈之間的空間應力（stericstrain）。蠶絲心蛋白幾乎徹低由扭曲的反平行β折疊片構成。膠原蛋白是動物結締組織中最豐盛的結構蛋白，有若干原膠原分子組成。原膠原是一種右手超螺旋結構，稱三股螺旋。彈性蛋白是結締組織中另一主要的結構蛋白質。蛋白質按其形狀和溶解度可分為纖維狀蛋白質、球狀蛋白質和膜蛋白。α-角蛋白、絲心蛋白（β-角蛋白）、教員蛋白和彈性蛋白是不溶性纖維狀蛋白質；肌球蛋白和原肌球蛋白是可溶性纖維狀蛋白質，是肌纖維中最豐盛的蛋白質。球狀蛋白質是一類可溶性的功能蛋白，如酶、抗體、轉運蛋白、蛋白質激素等，膜蛋白是一類與膜結構和功能緊密相關的蛋白質，它們又可分為膜內在蛋白質、脂錨定蛋白質以及膜周邊蛋白質。蛋白質結構普通被分為4個組織層次（折疊層次），一級、二級、三級和四級結構。細分時可在二、三級和四級結構。細分時可在二、三級之間增強超二級結構和結構域兩個層次。超二級結構是指在一級序列上相鄰的二級結構在三維折疊中彼此逼近并互相作用形成的組合體。超二級結構有3中基本形式：αα（螺旋束）、βαβ（如Rossman折疊）、ββ（β蜿蜒和希臘鑰匙拓撲結構）。結構域是在二級結構和超二級結構的基礎上形成并相對自立的三級結構局部折疊區(qū)。結構域常常也就是功能域。結構域的基本類型有：全平行α螺旋結構域、平行或混合型β折疊片結構域、反平行β折疊片結構域和富含金屬或二硫鍵結構域等4類。球狀蛋白質可按照它們的結構分為全α-結構蛋白質、α、β-結構蛋白質、全β-結構蛋白質和富含金屬或二硫鍵蛋白質等。球狀蛋白質有些是單亞基的，稱單體蛋白質，有些是多亞基的，稱寡聚或多聚蛋白質。亞基普通是一條多胎鏈。亞基（包括單體蛋白質）的總三維結構稱三級結構。球狀蛋白質種類無數，結構也很復雜，各有自己獨特的三維結構。但球狀蛋白質分子仍有某些共同的結構特征：①一種分子可含多種二級結構元件，②具有顯然的折疊層次，③緊密折疊成球狀或橢球狀結構，④疏水測鏈埋藏在分子內部，親水基團裸露在分子表面，⑤分子表面往往有一個空穴（活性部位）。蛋白質受到某些物理或化學因素作用時，引起生物活性走失，溶解度降低以及其他的物理化學常數的改變，這種現象稱為蛋白質變性。變性實質是非共價鍵破碎，天然構象解體，但共價鍵未遭破碎。有些變性是可逆的。蛋白質變性和復性實驗表明，一級結構規(guī)定它的三維結構。蛋白質的生物學功能是蛋白質天然構象所具有的性質。天然構象是在生理條件下熱力學上最穩(wěn)定的即自由能最低的三維結構。蛋白質折疊不是通過隨機搜索找到自由能最低構象的。折疊動力學研究表明，多肽鏈折疊過程中存在熔球態(tài)的中間體，并有異構酶和朋友蛋白質等參加。寡聚蛋白是由兩個或多個亞基通過非共價互相作用締合而成的聚攏體。締合形成聚攏體的方式構成蛋白質的四級結構，它涉及亞級在聚攏體中的空間羅列（對稱性）以及亞基之間的接觸位點（結構互補）和作使勁（非共價互相作用的類型）。習題1.（1）計算一個含有78個氨基酸的α螺旋的軸長。（2）此多肽的α螺旋徹低舒展時多長？[11.7nm；28.08nm]解：（1）α螺旋中每個殘基繞軸旋轉100°，沿軸升高0.15nm，故該α螺旋的軸長為：78×0.15nm=11.7nm(2)α螺旋每圈螺旋占3.6個氨基酸殘基，故該α螺旋圈數為：78÷3.6圈；α螺旋的直徑約為0.5nm，故每圈軸長為0.5πnm。徹低舒展的α螺旋長度約為：0.5π×（78÷3.6）≌34.01nm。2.某一蛋白質的多肽鏈除一些區(qū)段為α螺旋構想外，其他區(qū)段均為β折疊片構象。該蛋白質相對分子質量為240000，多肽鏈外姓的長度為5.06×10-5cm。試計算：α螺旋占該多肽鏈的百分數。（假設β解：普通來講氨基酸的平均分子量為120Da，此蛋白質的分子量為240000Da，所以氨基酸殘基數為240000÷120=2000個。設有X個氨基酸殘基呈α螺旋結構，則：X·0.15+（2000-X）×0.35=5.06×10-5×107=506nm解之得X=970，α螺旋的長度為970×0.15=145.5，故α-螺旋占該蛋白質分子的百分比為：145.5/536×100%=29%3.固然在真空中氫鍵鍵能約為20kj/mol，但在折疊的蛋白質中它對蛋白質的桅頂焓貢獻卻要小得多（<5kj/mol）。試解釋這種差別的緣故。[在舒展的蛋白質中大多數氫鍵的共體和接納體都與水形成氫鍵。折舊時氫鍵能量對穩(wěn)定焓貢獻小的緣故。]4.多聚甘氨酸是一個容易的多肽，能形成一個具有φ=-80°ψ=+120°的螺旋，按照拉氏構象圖（圖5-13），描述該螺旋的（a）手性；（b）每圈的堿基數。[（a）左手；（b）3.0]解：據P206圖5-13拉氏構象圖，=φ-80°ψ=+120°時可知該螺旋為左手性，每圈殘基數為3.0。5.α螺旋的穩(wěn)定性不僅取決于肽鏈間的氫鍵形成，而且還取決于肽鏈的氨基酸側鏈的性質。試預測在室溫下的溶液中下列多聚氨基酸那些種將形成α螺旋，那些種形成其他的有規(guī)矩的結構，那些種不能形成有規(guī)矩的結構？并說明理由。（1）多聚亮氨酸，pH=7.0；（2）多聚異亮氨酸，pH=7.0；（3）多聚精氨酸，pH=7.0；（4）多聚精氨酸，pH=13；（5）多聚谷氨酸，pH=1.5；（6）多聚蘇氨酸，pH=7.0；（7）多聚脯氨酸，pH=7.0；[（1）（4）和（5）能形成α螺旋；（2）（3）和（6）不能形成有規(guī)矩的結構；（7）有規(guī)矩，但不是α螺旋]6.多聚甘氨酸的右手或左手α螺旋中哪一個比較穩(wěn)定？為什么？[因為甘氨酸是在α-碳原子上呈對稱的異常氨基酸，因此可以預料多聚甘氨酸的左右手α螺旋（他們是對映體）在能量上是相當的，因而也是同等穩(wěn)定的。]7.考慮一個小的含101殘基的蛋白質。該蛋白質將有200個可旋轉的鍵。并假設對每個鍵φ和ψ有亮個定向。問：（a）這個蛋白質可能有多種隨機構象（W）？（b）按照（a）的答案計算在當使1mol該蛋白質折疊成惟獨一種構想的結構時構想熵的變化（ΔS折疊）；（c）倘若蛋白質徹低折疊成由H鍵作為穩(wěn)定焓的唯一來源的α螺旋，并且每molH鍵對焓的貢獻為-5kj/mol，試計算ΔH折疊；（d）按照逆的（b）和（c）的答案，計算25℃時蛋白質的ΔG折疊。該蛋白質的折疊形式在25[（a）W=2200=1.61×1060；（b）ΔS折疊=1.15kj/（K·mol）（c）ΔH折疊100×（-5kj/mol）=-500kj/mol；注重，這里我們沒有考慮在螺旋末端處某些氫鍵不能形成這一事實，但考慮與否差別很小。（d）ΔG折疊=-157.3kj/mol.因為在25℃時ΔG折疊8.兩個多肽鏈A和B，有著相似的三級結構。但是在正常情況下A是以單體相識存在的，而B是以四聚體（B4）形式存在的，問A和B的氨基酸組成可能有什么差別。[在亞基-亞基互相作用中疏水互相作用常常起主要作用，參加四聚體B4的亞基-亞基互相作用的表面可能比單體A的對應表面具有較多的疏水殘基。]9.下面的序列是一個球狀蛋白質的一部分。利用表5-6中的數據和Chou-Faman的經驗規(guī)矩，預測此區(qū)域的二級結構。RRPVVLMAACLRPVVFITYGDGGTYYHWYH[殘基4-11是一個α螺旋，殘基14-19和24-30是β折疊片。殘基20-23很可能形成β轉角]10.從熱力學考慮，徹低裸露在水環(huán)境中和徹低埋藏在蛋白質分子非極性內部的兩種多肽片段，哪一種更容易形成α螺旋？為什么？[埋藏在蛋白質的非極性內部時更容易形成α螺旋。因為在水環(huán)境中多肽對穩(wěn)定焓（ΔH折疊）的貢獻要小些。]11.一種酶相對分子質量為300000，在酸性環(huán)境中可解理成兩個不同組分，其中一個組分的相對分子質量為100000，另一個為50000。大的組分占總蛋白質的三分之二，具有催化活性。用β-巰基乙醇（能還原二硫橋）處理時，大的失去催化能力，并且它的沉降速度減小，但沉降圖案上只展示一個峰（參見第7章）。關于該酶的結構作出什么結論？[此酶含4個亞基，兩個無活性亞基的相對分子質量為50000，兩個催化亞基的相對分子質量為100000，每個催化亞基是由兩條無活性的多肽鏈（相對分子質量為50000）組成。彼此間由二硫鍵交聯在一起。]12.今有一種植物的毒素蛋白，直接用SDS凝膠電泳分析（見第7章）時，它的區(qū)帶位于肌紅蛋白（相對分子質量為16900）和β-乳球蛋白（相對分子質量37100）良種蛋白之間，當這個毒素蛋白用β-巰基乙醇和碘乙酸處理后，在SDS凝膠電泳中仍得到一條區(qū)帶，但其位置逼近標記蛋白細胞素（相對分子質量為13370），進一步實驗表明，該毒素蛋白與FDNB反應并酸水解后，釋放出游離的DNP-Gly和DNP-Tyr。關于此蛋白的結構，你能做出什么結論？[該毒素蛋白由兩條不同的多肽鏈通過鏈間二硫鍵交聯而成，每條多肽鏈的相對分子質量各在13000左右。]13.一種蛋白質是由相同亞基組成的四聚體。（a）對該分子說出來年各種可能的對稱性。穩(wěn)定締合的是哪種類型的互相作用（同種或異種）？（b）假設四聚體，如血紅蛋白，是由兩個相同的單位（每個單位含α和β兩種鏈）組成的。問它的最高對稱性是什么？[（a）C4和D2，C4是通過異種互相作用締合在一起，D2是通過同種互相作用締合在一起，（b）C2因為每個αβ二聚體是一個不對稱的原聚體]14.證實一個多階段裝配過程比一個單階段裝配過程更容易控制蛋白質的質量?？紤]一個多聚體酶復合物的合成，此復合物含6個相同的二聚體，每個二聚體由一個多肽A和一個B組成，多肽A和B的長度分離為300個和700個氨基酸殘基。假設從氨基酸合成多肽鏈，多肽鏈組成二聚體，再從二聚體聚攏成多聚體酶，在這一建造過程中每次操作的錯誤頻率為10-8，假設氨基酸序列沒有錯誤的話，多肽的折疊總是準確的，并假設在每一裝配階段剔除有缺陷的亞結構效率為100%，試比較在下列情況下有缺陷復合物的頻率：（1）該復合物以一條6000個氨基酸延續(xù)的多肽鏈一步合成，鏈內含有6個多肽A和6個多肽B。（2）該復合物分3個階段形成：第一階段，多肽A和B的合成；第二階段，AB二聚體的形成；第三階段，6個AB二聚體裝配成復合物。[（1）有缺陷復合物的平均頻率是6000×10-8=6×10-5][（2）因為有缺陷的二聚體可被剔除，因此有缺陷復合物的平均率只是最后階段的操作次數（5此操作裝配6個亞基）乘以錯誤頻率，即：5×10-8。因此它比一步合成所產生的缺陷頻率約低1000倍。]第六章蛋白質結構與功能的關系提要肌紅蛋白（Mb）和血紅蛋白（Hb）是脊椎動物中的載氧蛋白質。肌紅蛋白便于氧在肌肉中轉運，并作為氧的可逆性貯庫。而血紅蛋白是血液中的氧載體。這些蛋白質含有一個結合得很緊的血紅素輔基。它是一個取代的卟啉，在其中央有一個鐵原子。亞鐵（Fe2+）態(tài)的血紅素能結合氧，但高鐵（+3）態(tài)的不能結合氧。紅血素中的鐵原子還能結合其他小分子如CO、NO等。肌紅蛋白是一個單一的多肽鏈，含153個殘基，形狀緊湊。Mb內部幾乎都是非極性殘基。多肽鏈中約75%是α螺旋，共分八個螺旋段。一個亞鐵血紅素即位于疏水的空穴內，它可以保護鐵不被氧化成高鐵。血紅素鐵離子直接與一個His側鏈的氮原子結合。此近側His（H8）占領5個配位位置。第6個配位位置是O2的結合部位。在此附近的遠側His（E7）降低在氧結合部位上CO的結合，并抑制血紅素氧化或高鐵態(tài)。氧與Mb結合是可逆的。對單體蛋白質如Mb來說，被配體（如）O2占領的結合部位的分數是配體濃度的雙曲線函數，如Mb的氧集合曲線。血紅蛋白由4個亞基（多肽鏈）組成，每個亞基都有一個血紅素基。HbA是成人中主要的血紅蛋白，具有α2β2的亞基結構。四聚體血紅蛋白中浮上了單體血紅蛋白所不具有的新性質，Hb除運載氧外還能轉運H+和CO2。血紅蛋白以兩種可以互相轉化的構象態(tài)存在，稱T（緊張）和R（松弛）態(tài)。T態(tài)是通過幾個鹽橋穩(wěn)定的。無氧結合時達到最穩(wěn)定。氧的結合促進T態(tài)改變?yōu)镽態(tài)。氧與血紅蛋白的結合是別構結合行為的一個典型例證。T態(tài)和R態(tài)之間的構象變化是由亞基-亞基互相作用所介導的，它導致血紅蛋白浮上別構現象。Hb展示3種別構效應。第一，血紅蛋白的氧結合曲線是S形的，這以為著氧的結合是協(xié)同性的。氧與一個血紅素結合有助于氧與同一分子中的其他血紅素結合。第二，H+和CO2促進O2從血紅蛋白中釋放，這是生理上的一個重要效應，它提高O2在代謝活躍的組織如肌肉的釋放。相反的，O2促進H+和CO2在肺泡毛細血管中的釋放。H+、CO2和O2的結合之間的別構聯系稱為Bohr效應。第三，血紅蛋白對O2的親和力還受2、3-二磷酸甘油酸（BPG）調節(jié)，BPG是一個負電荷密度很高的小分子。BPG能與去氧血紅蛋白結合，但不能與氧合血紅蛋白結合。因此，BPG是降低血紅蛋白對氧的親和力的。胎兒血紅蛋白（α2β2）比成年人的血紅蛋白（α2β2）有較高的氧親和力，就是因為它結合BPG較少。導致一個蛋白質中氨基酸改變的基因突變能產生所謂分子病，這是一種遺傳病。了解最清晰的分子病是鐮刀狀細胞貧血病。這種病人的步正常血紅蛋白稱為HbS，它只是在兩條β鏈第六位置上的Glu倍置換乘Val。這一改變在血紅蛋白表面上產生一個疏水小區(qū)，因而導致血紅蛋白聚攏成不溶性的纖維束，并引起紅細胞鐮刀狀化和輸氧能力降低。純合子的病人浮上慢性貧血而死亡。地中海貧血是因為缺失一個或多個編碼血紅蛋白鏈的基因造成的。棉衣反映是由特化的白細胞——淋巴細胞和巨噬細胞及其相關的蛋白質之間的互相作用介導的。T淋巴細胞產生T細胞受體，B淋巴細胞產生免疫球蛋白，即抗體。所有的細胞都能產生MHC蛋白，它們在細胞表面展示宿主（自我）肽或抗原（非自我）肽。助T細胞誘導那些產生免疫球蛋白的B細胞和產生T細胞受體的胞毒T細胞增殖。免疫球蛋白或T細胞受體能與特異的抗原結合。一個特定的祖先細胞通過刺激繁殖，產生一個具有同樣免疫能力的細胞群的過程稱為克隆挑選。人類具有5個類別的免疫球蛋白，每一類別的生物學功能都是不同的。最豐盛的是IgG類，它由4條多肽鏈組成，兩條重鏈，兩條輕鏈，通過二硫鍵銜接成Y形結構的分子。逼近Y的兩“臂”頂端的結構域是多變區(qū)，形成來年各個抗原結合部位。一個給頂的免疫球蛋白普通只結合一個大抗原分子的一部分，稱為表位。結合常常涉及IgG的構象變化，以便域抗原誘導契合。因為抗體容易制取并具有高度特異性，它成為許多分析和制備生化主意的核心，如酶聯免疫吸附測定（ELISA）、Western印跡和單克隆抗體技術等都得到廣泛應用。在發(fā)動機蛋白質中蛋白質-配體互相作用上空間和時光的組織達到相當完美的程度。肌肉收縮是因為肌球蛋白和肌動蛋白“精心安頓”的互相作用的結果。肌球蛋白是由纖維狀的尾和球狀的頭組成的棒狀分子，在肌肉中倍組織成粗絲。G-肌動蛋白是一種單體，由它聚攏成纖維狀的F-肌動蛋白，后者是細絲的主體。由粗絲和細絲構成肌肉收縮單位——肌節(jié)。肌球蛋白上的ATP水解與肌球蛋白頭片的系列構象變化相偶聯，引起肌球蛋白頭從F-肌動蛋白亞基上解離并與細絲前方的另一F-肌動蛋白亞基再結合。因此肌球蛋白沿肌動蛋白細絲滑動。肌肉收縮受從肌質網釋放的Ga2+刺激。Ga2+與肌鈣蛋白結合導致肌鈣蛋白-原肌球蛋白復合體的構象變化，引發(fā)肌動蛋白-肌球蛋白0互相作用的循環(huán)發(fā)生。習題1.蛋白質A和B各有一個配體X的結合部位，前者的解離常數Kd為10-6mol/L。（a）哪個蛋白質對配體X的親和力更高？（b）將這兩個蛋白質的Kd轉換為結合常數Ka。[（a）蛋白質B；（b）蛋白質A的Ka=106(mol/L)-1，蛋白質B的Ka=10-9(mol/L)-12.下列變化對肌紅蛋白和血紅蛋白的O2親和力有什么影響？（a）血漿的pH從7.4降到7.2；（b）肺中CO2分壓從45torr（屏息）降到15torr（正常）；（c）BPG水平從4.5mmol/L（海平面）增至7.5mmol（高空）。[對肌紅蛋白：（a）無；（b）無；（c）無。對血紅蛋白：（a）降低；（b）增強；（c）降低]3.在37℃，pH7.4，CO2p（O2）%飽和度（=100×Y）10.61019.53027.45037.57050.48577.39692.398（a）按照這些數據，繪制氧結合曲線；估算在（1）100torrp（O2）(肺中)和（2）30torrp（O2）（靜脈血中）下血的氧百分飽和度。（b）肺中[100torrp（O2）]結合的氧有百分之多少輸送給組織[30torrp（O2）]？（c）倘若在毛細血管中pH降到7.0，利用圖6-17數據重新估算（b）部分。[（a）（1）98%，（2）58%；（b）約40%；（c）約50%]解：（a）圖略，從圖中克知分離為98%和58%；（b）98%-58%=40%，故約40%；（c）當pH降到7.0時，據圖6-17可知：96%-46%=50%。4.倘若已知P50和n，可利用方程（6-15）Y/（1-Y）=[p（O2）/P50]n計算Y（血紅蛋白氧分數飽和度）。設P50=26torr，n=2.8，計算肺（這里p（O2）=100torr）中的Y和毛細血管（這里p（O2）=40torr）中的Y。在這些條件下輸氧效率（Y肺-Y毛細血管=ΔY）是多少？除n=1.0外，重復上面計算。比較n=2.8和n=1.0時的ΔY值。并說出協(xié)同氧結合對血紅蛋白輸氧效率的影響。[n=2.8時，Y肺=0.98，Y毛細血管=0.77，所以，ΔY=0.21，n=1.0時，Y肺=0.79，Y毛細血管=0.61，所以，ΔY=0.18，兩ΔY之差0.21-0.18=0.03，差值似乎不大，但在代謝活躍的組織中p（O2）<40torr，因此潛在輸氧效率不小，參見圖6-15]解：Y肺/（1-Y肺）=[100/26]2.8Y肺=0.98Y毛/（1-Y毛）=[40/26]2.8Y毛=0.77ΔY=0.98-0.77=0.21當n=1.0時，同理，Y肺=0.79Y毛=0.61ΔY=0.185.倘若不采取措施，儲藏相當初光的血，2.3-BPG的含量會下降。倘若這樣的血用于輸血可能會產生什么后果？[儲藏過時的紅血球經酵解途徑代謝BPG。BPG濃度下降，Hb對O2的親和力增強，致使不能給組織供氧。采納這種BPG濃度低的輸血，病人可能被窒息。]6.HbA能抑制HbS形成細長纖維和紅細胞在脫氧后的鐮刀狀化。為什么HbA具有這一效應？[去氧HbA含有一個互補部位，因而它能加到去氧HbS纖維上。這樣的纖維不能繼續(xù)延伸，因為末端的去氧HbA分子缺少“粘性”區(qū)。]7.一個單克隆抗體與G-肌動蛋白結合但不與F-肌動蛋白結合，這對于抗體識別抗原表位能告訴你什么？[該表位可能是當G-肌動蛋白聚合成F-肌動蛋白時被埋藏的那部分結構。]8．假設一個Fab-半抗原復合體的解離常數在25℃和pH7時為5×10-7mol/L。（a）結合的標準自由能（25℃和pH7時）是多少？（b）此Fab的親和力結合常數是多少？（c）從該復合體中釋放半抗原的速度常數為120S-1。結合的速度常數是多少？此說明在結合半抗原時抗體中的結構變化是大還是??？[（a）ΔG0ˊ=35.9kj/mol；（b）Ka=2×106mol-1L；（c）結合速度常數k=2×108mol-1S-1L，此值臨近于小分子與蛋白質相遇（結合）的蔓延控制限制（108至109mol9.抗原與抗體的結合方式與血紅蛋白的氧結合相似。假設抗原是一價，抗體是n價，即6抗體分子有n個結合部位，且各結合部位的結合常數Ka值是相同的，則可證實當游離抗原濃度為[L]時，結合到抗體上的抗原濃度[Lp]與抗體的總濃度[Pr]之比值，N=[Lp]/[Pr]=(nKa[L])/(1+Ka[L])N實際上表示被一個抗體分子結合的抗原分子平均數。（a）證實上面的方程可重排為N/[L]=Kan-KaN此方程式稱Scatchard方程，方程表明，N/[L]對N作圖將是一條直線。（b）按照Scatchard方程，利用下列數據作圖求出抗體-抗原反應的n和Ka值。[L]mol/LN1.43×10-50.52.57×10-50.776.00×10-51.201.68×10-41.683.70×10-41.85[（a）第一個方程兩邊各乘（1+Ka[L]），然后兩邊各除以[L]，并重排第2個方程；（b）按照第二方程，N/[L]對N作圖的斜率是-Ka，N/[L]=0時的截距給出n。利用數據作圖得Ka=2.2×10-4mol/L，n=2.1。因為結合部位數目只可能是整數，所以n=2]10.一個典型的松弛肌節(jié)中細絲長約2μm，粗絲長約為1.5μm。（a）估算在松弛和收縮時粗絲和細絲的重疊情況。（b）一次循環(huán)中肌球蛋白沿細絲滑行“一步”移動約7.5nm，問一次收縮中每個肌動蛋白纖維需要舉行多少個步？[（a）約0.75nm，（b）約67步]解：（a）按照P281圖6-35A所示，當松弛是重疊總長度為：（1+1）-（3-1.5）=0.5μm0.5/2=0.25μm當收縮時重疊總長度為：（1+1）-（2-1.5）=1.5μm1.5/2=0.75μm（b）（3-2）÷2×103÷7.5≌67步第七章蛋白質的分離、純化和表征提要蛋白質也是一種兩性電解質。它的酸堿性質主要決定于肽鏈上可解離的R基團。對某些蛋白質說，在某一pH下它所帶的正電荷與負電荷相等，即凈電荷為零，此pH稱為蛋白質的等電點。各種蛋白質都有自己特定的等電點。在等電點以上的pH時蛋白質分子帶凈負電荷，在等電點以下的pH時帶凈正電荷。蛋白質處于等電點時溶解度最小。在無鹽類干擾情況下，一種蛋白質的質子供體基團解離出來的質子數與質子受體基團結合的質子數相等時的pH是它的真正等電點，稱為等離子點，它是該蛋白質的特征常數。測定蛋白質相對分子質量（Mr）的最重要的主意是利用超速離心機的沉降速度法和沉降平衡法。沉降系數（s）的定義是單位離心場強度的沉降速度。s也常用來近似地描述生物大分子的大小。凝膠過濾是一種簡便的測定蛋白質Mr的主意。SDS-聚丙乙酰胺凝膠電泳（PAEG）用于測定單體蛋白質或亞基的Mr。蛋白質溶液是親水膠體系統(tǒng)。蛋白質分子顆粒（直徑1～100nm）是系統(tǒng)的凝聚相，水是凝聚介質。蛋白質分子顆粒周圍的雙電層和水化層是穩(wěn)定蛋白質膠體系統(tǒng)的主要因素。分離蛋白質混合物的各種主意主要按照蛋白質在溶液中的下列性質：（1）分子大?。唬?）溶解度；（3）電荷；（4）吸附性質；（5）對配體分子特異的生物學親和力。透析和超過濾是利用蛋白質不能通過半透膜的性質使蛋白質分子和小分子分開，常用于濃縮和脫鹽。密度梯度離心和凝膠過濾層析都已勝利地用于分離蛋白質混合物。等電點沉淀、鹽析和有機溶劑分級分離等主意常用于蛋白質分離的頭幾步。移動界面電泳、各種形式的區(qū)帶電泳，異常是圓盤凝膠電泳、毛細血管電泳以及等電聚焦具有很高的分辨率。纖維素離子交換劑和Sephadex離子交換劑的離子交換柱層析已廣泛地用于蛋白質的分離純化。HPLC和親和層析法是十分有效的分離純化主意。蛋白質制品的純度鑒定通常采用分辨率高的物理化學主意，例如PAGE、等電聚焦、毛細血管電泳、沉降分析和HPLC等。倘若制品是純的，在這些分析的圖譜上只展示一個峰或一條帶。必須指出，任何單獨鑒定只能認為是蛋白質分子均醫(yī)性的須要條件而不是充足條件。習題1.測得一種血紅素蛋白質含0.426%鐵，計算最低相對分子質量。一種純酶按分量計算含亮氨酸1.65%和異亮氨酸的分子質量都是2.48%，問其最低相對分子質量是多少？[13110；15870]解：（1）蛋白質MV=55.8÷0.426%=13100（2）亮氨酸和異亮氨酸的分子質量都是131Da，按照兩種氨基酸的含量來看，異亮氨酸：亮氨酸=2.48%：1.65%=3：2，所以在此蛋白質中的亮氨酸至少有兩個，異亮氨酸至少有三個，那么：1.65%=2×（131-18）÷蛋白質MV蛋白質MV=14581Da。2.超速離心機的轉速為58000r/min時，（1）計算角速度ω，以rad/s表示；（2）計算距旋轉中央6.2cm處的離心加速度a；（3）此離心加速度相當于重力加速度“g”的多少倍？[（1）ω=6070.7rad/s（2）a=2.284×108cm/s2；（3）a=解：（1）ω=58000×2π/60=6070.7rad/s（2）a=（6070.7）2×6.2=2.285×108cm（3）2.285×108/9.8=63.一種蛋白質的偏微比容為0.707cm2/g,當溫度校正為20℃，溶劑校正為水時蔓延系數（D20.W）為13.1×10-7cm2/s.沉降系數（S20.W）為2.05S。20℃時水的密度為0.998g解：Mr=(RTs)/[D(1-υρ)]=8.314×（273+20）×2.05/[13.1×10-7（1-0.707×0.998）]=130004.一個層析柱中負頂相體積（Vs）為流動相體積（Vm）的1/5。假設某化合物的分配系數，（a）Kd=1；（b）Kd=50。計算該化合物的有效分配系數（Keff），也稱容量因子（capacity）。[（a）Keff=0.2；(b)Keff=10]5.指出從分子排阻層析柱上洗脫下列蛋白質時的順序。分離蛋白質的范圍是5000到400000；肌紅蛋白、過氧化氫酶、細胞色素C、肌球蛋白、胰凝乳蛋白酶原和血清清蛋白（它們的Mr見表7-4）。[肌球蛋白、過氧化氫酶、血清清蛋白、胰凝乳蛋白酶原、肌紅蛋白、細胞色素C]6.由第5題所述的，從分子排阻層析柱上洗脫細胞色素C、β-乳球蛋白和血清紅蛋白時，其洗脫體積分離為118、58、37和24ml，問未知蛋白的Mr是多少？假定所有蛋白質都是球形的，并且都處于柱的分級分離范圍。[52000]7.在下面指出的pH下，下述蛋白質在電場中相哪個方向移動，即向正極、負極還是不動？（按照表7-2的數據判斷。）（1）血清蛋白，pH5.0；（2）β-乳球蛋白，pH5.0和7.0；（3）胰凝乳蛋白酶原，pH5.0、9.1和11。[（1）正極；（2）負極、正極；（3）負極、不動、正極]解：（1）卵清蛋白pI=4.6，pH=5.0>4.6帶負電，向正極移動；（2）β-乳球蛋白pI=5.2，pH=5.0<5.2帶正電，向負極移動；pH=7.0>5.2帶負電，向正極移動；（3）胰凝乳蛋白酶原pI=9.1，pH=5.0<9.1帶正電，向負極移動；pH=9.1=pI凈電荷為零，不移動；pH=11>9.1帶負電，向正極移動；8.（1）當Ala、Ser、Phe、Leu、Arg、Asp和His的混合物在pH3.9舉行紙電泳時，哪些氨基酸移向正極？哪些氨基酸移向負極？（2）紙電泳時，帶有相同電荷的氨基酸常有少許分開，例如Gly可與Leu分開，試說明為什么？（3）設Ala、Val、Glu、Lys和Thr的混合物pH為6.0，試指出紙電泳后氨基酸的分離情況。PI值：Ala：6.02Ser：5.68Phe：5.48Leu：5.98Arg：10.76Asp：2.97His：7.59[（1）Ala、Ser、Phe和Leu以及Arg和His向負極，Asp移向正極；（2）電泳時，具有相同電荷的較大分子比較小分子移動得慢，因為電荷/質量之比較小，因而引起每單位質量遷移的驅動力也較小。（3）Glu移向正極，Lys移向負極,Val、Ala和Thr則留在原點。]9.凝膠過濾層析和凝膠電泳中的分子篩效應有什么不同？為什么？10.配制一系列牛血清清蛋白（BSA）稀釋液，每一種溶液取0.1ml舉行Bradford法測定。對適當的空白測定595nm波長處的光吸收（A595）。結果如下表所示：BSA濃度（mg·L-1）A590.970.80.790.60.590.40.370.20.17BSA濃度對A595作圖得標準曲線。E.coli的蛋白質提取液樣品（0.1ml）測得的A595為0.84。按照標準曲線算出E.coli提取液中的蛋白質濃度。[0.85mg/ml]解：標準曲線略。由標準曲線可知，當A595為0.84時，BSA濃度為0.85mg/ml。第八章酶通論提要生物體內的各種化學變化都是在酶催化下舉行的。酶是由生物細胞產生的，受多種因素調節(jié)控制的具有催化能力的生物催化劑。與普通催化劑相比有其共同性，但又有顯著的特點，酶的催化效率高，具有高度的專一性，酶的活性受多種因素調節(jié)控制，酶作用條件溫暖，但不夠穩(wěn)定。酶的化學本質除有催化活性的RNA分子之外都是蛋白質。按照酶的化學組成可分為單純蛋白質和綴合蛋白質是由不表現酶活力的脫輔酶及輔因子（包括輔酶、輔基及某些金屬離子）兩部分組成。脫輔酶部分決定酶催化的專一性，而輔酶（或輔基）在酶催化作用中通常起傳遞電子、原子或某些化學基團的作用。按照各種酶所催化反應的類型，把酶分為六大類，即氧化還原酶類、轉移酶類、水解酶類、裂合酶類、異構酶類和銜接酶類。按規(guī)定每種酶都有一個習慣名稱和國際系統(tǒng)名稱，并且有一個編號。酶對催化的底物有高度的挑選性，即專一性。酶往往只能催化一種或一類反應，作用于一種或一類物質。酶的專一性可分為結構專一性和立體異構專一性兩種類型。用“誘導契合說”解釋酶的專一性已被人們所采納。酶的分離純化是酶學研究的基礎。已知大多數酶的本質是蛋白質，因此用分離純化蛋白質的主意純化酶，不過要注重挑選合適的材料，操作條件要溫暖。在酶的制備過程中，沒一步都要測定酶的活力和比活力，以了解酶的回收率及提純倍數，以便判斷提純的效果。酶活力是指在一定條件下酶催化某一化學反應的能力，可用反應初速率來表示。測定酶活力及測酶反應的初速率。酶活力大小來表示酶含量的多少。20世紀80年代初，Cech和Altmsn分離發(fā)現了某些RNA分子具有催化作用，定名為核酶（ribozyme）。有催化分子內和分分子間反應的核酶。具有催化功能RNA的發(fā)現，開辟了生物化學研究的新領域，提出了生命起源的新概念。按照發(fā)夾狀或錘頭狀二級結構原理，可以設計出各種人工核酶，用作抗病毒和抗腫瘤的防治藥物將會有良好的應用前景。抗體酶是一種具有催化能力的蛋白質，本質上是免疫球蛋白，但是在易變區(qū)賦予了酶的屬性。按照酶催化的過度態(tài)理論，設計各種過度態(tài)類似物作為半抗原免疫動物，篩選具有催化活性的單抗?？贵w酶具有酶的一切性質?，F已研制出催化多種反應的抗體酶。抗體酶的發(fā)現，不僅為酶的過度態(tài)理論提供了有力的實驗證據，而且抗體酶將會得到廣泛的應用。酶工程是將酶學原理與化學工程技術及基因重組技術有機結合而形成的新型應用技術，是生物工程的支柱。按照研究和解決問題的手段不同將酶工程分為化學酶工程和生物酶工程。隨著化學工程技術及基因工程技術的發(fā)展，酶工程發(fā)展更為疾馳，必將成為一個很大的生物技術產業(yè)。習題1.酶作為生物催化劑有哪些特點？答：酶是細胞所產生的，受多種因素調節(jié)控制的具有催化能力的生物催化劑，與普通非生物催化劑相比較有以下幾個特點：1、酶易失活；2、具有很高的催化效率；3、具有高度專一性；4、酶活性受到調節(jié)和控制。2.何謂酶的專一性？酶的專一性有哪些？如何解釋酶作用的專一性？研究酶的專一性有何意義？答：酶的專一性是指酶對催化的反應和反映物有鄭重的挑選性。酶的專一性分為兩種類型：1、結構專一性，包括絕對專一性、相對專一性（族專一性或基團專一性、鍵專一性）；2、立體異構專一性，包括旋光異構專一性、幾何異構專一性。通過對酶結構與功能的研究，確信酶與底物作用的專一性是因為酶與底物分子的結構互補，誘導契合，通過分子的互相識別而產生的。對酶的專一性研究具有重要的生物學意義。它有利于闡明生物體內有序的代謝過程，酶的作用機制等。3.酶的活性受那些因素調節(jié)，試說明之。答：酶的調節(jié)和控制有多種方式，主要有：（1）調節(jié)酶的濃度：主要有2種方式：誘導或抑制酶的合成；調節(jié)酶的降解；（2）通過激素調節(jié)酶活性、激素通過與細胞膜或細胞內受體相結合而引起一系列生物學效應，以此來調節(jié)酶活性；（3）反饋抑制調節(jié)酶活性：許多小分子物質的合成是由一連串的反應組成的，催化此物質合成的第一步的酶，往往被他們終端產物抑制；（4）抑制劑和激活劑對酶活性的調節(jié)：酶受大分子抑制劑或小分子物質抑制，從而影響酶活性；（5）其他調節(jié)方式：通過別構酶、酶原的激活、酶的可逆共價修飾和同工酶來調節(jié)酶活性。４.輔基和輔酶有何不同？在酶催化反應種起什么作用？答：輔酶通常指與脫輔酶結合比較松弛的小分子有機物質。通過透析主意可以除去，如輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ等。輔基是以共價鍵和脫輔酶結合，不能通過透析除去，需要經過一定的化學處理才干與蛋白分開，如細胞色素氧化酶中的鐵卟啉，丙酮氧化酶中的黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）都屬于輔基。它們的區(qū)別只在于它們與脫輔酶結合的結實程度不同。輔酶、輔基在酶催化反應中通常是起著電子、原子或某些化學基團的傳遞作用。５.酶分哪幾大類？舉例說明酶的國際系統(tǒng)命名法及酶的編號。答：國際酶學委員會按照酶所催化反應的類型，把酶分為６大類：即氧化還原酶類、轉移酶類、水解酶類、裂合酶類、異構酶類和銜接酶類。分離利用1、2、3、4、5、6來表示。例如：1.1.3表示氧化還原酶，作用于CHOH基團，受體是分子氧。按照底物中別所用的基團或鍵的特點將每一大類分為若干亞類，每一個亞類又按順序變成1、2、3……等數字；每一個亞基可再分亞亞類，仍用1、2、3……編號，每一個每的分類編號由4個數字組成，數字間由由“·”隔開。第一個數字指明該酶屬于哪一個亞類；第三個數字指出該酶屬于一個亞亞類；第四個數字則表明該酶在亞亞類中的排號。編號之間冠以EC（EnzymeCommision）。6.什么叫酶的活力和比活力？測定酶活力應注重什么？為什么測定酶活力時以測定初速率為宜，并且底物濃度遠遠大于酶濃度？答：酶活力指酶催化某一化學反應的能力，其大小可用在一定條件下所催化的某一化學反應的反應速率來表示；酶的比活力代表酶的純度，按照國際酶學委員會的規(guī)定比活力用每mg蛋白質所含的酶活力單位數表示。酶的催化作用受測定環(huán)境的影響，因此測定酶活力要在最適條件下舉行，即最適溫度、最適pH、最適底物濃度和最適緩沖離子強度等。惟獨在最適條件下測定才干真切反映酶活力的大小。隨時光的延伸，酶促反應中底物濃度降低，產物濃度增強，加速逆反應的舉行，產物對酶抑制或激活作用以及隨時光的延伸引起酶本身部分分子失活等，酶促反應速率降低，因此測定活力，應測定酶促反應的初速率，從而避免上述種種復雜因素對反應速率的影響。底物濃度太低時，5%以下的底物濃度變化實驗上不易測準，所以在測定酶的活力時，往往使第五濃度充足大，這樣囫圇酶反應對底物來說是零級反應，而對酶來說卻是以及反應，這樣測得的速率就比較可靠地反映酶的含量。7.什么叫核酶和抗體酶？它們的發(fā)現有什么重要意義？答：具有催化功能的RNA叫核酶。它的發(fā)現，表明RNA是一種既能攜帶遺傳信息又有生物催化功能的生物分子。因此很可能RNA早于蛋白質和DNA，是生命起源中首先浮上的生物大分子，而一些有酶活性的內含子可能是生物進化過程中殘存的分子“化石”。酶RNA的發(fā)現，提出了生物大分子和生命起源的新概念，無疑促進對生物進化和生命起源的研究?？贵w酶是20實際80年代后期才浮上的一種具有催化能力的蛋白質，其本質上是免疫球蛋白，但是在易變區(qū)被賦予了酶的屬性，所以又稱“催化性抗體”，抗體酶的發(fā)現，不僅為酶的過渡態(tài)理論提供了有力的實驗證據，而且抗體酶將會得到廣泛的應用。8.解釋下列名詞：（1）生物酶工程：酶學和以DNA重組技術為主的現代分子生物學技術相結合的產物。（2）固定化酶：將水溶性酶用物理或化學主意處理，使之成為不溶于水的、但仍具有酶活性的狀態(tài)。（3）活化能：在一定溫度下1mol底物所有進入活化狀態(tài)所需要的自由能（kj/mol）（4）酶的轉化數：在一定條件下每秒鐘每個酶分子轉換底物的分子數。（5）寡聚酶：由兩個以上亞基組成的酶。（6）Kat單位：在最適條件下，酶秒鐘催化1mol底物轉化為產物所需的酶量，為Kat單位。（7）酶偶聯分析法：因為分光光度法有其獨特的優(yōu)點，因此把一些遠類沒有光吸收變化的酶反應，可以通過與一些能引起光吸收變化的酶反映偶聯使第一個酶反映的產物改變成第二個酶的具有光吸收變化的產物來舉行測量。（8）誘導契合說：1958年Koshland提出，當酶分子與底物分子臨近時，酶蛋白受底物分子誘導，其構想發(fā)生有利于底物結合的變化，酶與底物在此基礎上互補契合舉行反應。（9）反饋抑制：許多小分子物質的合成是由一聯串的反應組成的，催化此物質生成的第一步的酶，往往被它們終端產物抑制。這種抑制叫反饋抑制。（10）多酶復合體：由幾種酶靠非共價鍵彼此嵌合而成。9.用AgNO3對在10ml含有1.0mg/ml蛋白質的純酶溶液舉行全抑制，需用0.342μmolAgNO3，求該酶的最低相對分子質量。10.1μg純酶（Mr:92×103）在最適條件下，催化反應速率為0.5μmol/min，試計算：（1）酶的比活力。[500U/mg]（2）轉換數。[766.7s-1]解：（1）比活力=0.5μmol/min/1μg=500U/mg（2）轉換數=0.5/60×1÷（1×10-6/92×103×106）=766.7s-111.1g鮮重的肌肉含有40單位的某種酶，其轉換數為6×104min-1，試計算該酶在細胞內濃度（假設清新組織含水80%，并且所有在細胞內）。[8.33×10-7mol/L]解：1/6×104×40÷（1×80%×103）=[8.33×10-7mol/L12.焦磷酸酶可以催化焦磷酸水解或磷酸，其相對分子質量為120×103，由6個相同亞基組成。純酶的Vmax為2800U/mg酶。它的一個活力單位規(guī)定為：在標準測定條件下，37℃、15min內水解10μmol焦磷酸所需要的酶量。問：（1）酶mg酶在每秒鐘內水解多少mol底物？[3.11×10-5mol]。（2）每mg酶中有多少mol的活性部位（假設每個亞基上有一個活性部位）？[5×10-8mol活性中央]。（3）酶的轉換數是多少？[622s-1或622mol焦磷酸/（s·解：（1）2800×10/15×1/（60×106）×1=3.11×10-5mol（2）1×10-3/120×103×6=5×10-8mol（3）3.11×10-5÷1×10-3/120×103×1/6=62213.稱取25mg蛋白酶粉配制成25ml酶溶液，從中取出0.1ml酶液，以酪蛋白為底物，用Folin-酚比色法測定酶活力，得知每小時產生1500μg酪氨酸。另取2ml酶液，用凱氏定氮法測得蛋白質為0.2mg，若以每分鐘產生1μg酪氨酸的酶量為1個活力單位計算，按照以上數據，求出：（1）1ml酶液中所含蛋白質量及活力單位。[0.625mg蛋白質，250U]（2）比活力。[400U/mg蛋白質]（3）1g酶制劑的總蛋白含量及總活力。[0.625g，2.5×105U]解：（1）0.2×6.25÷（2×25/25）=0.625mg1500/60÷（0.1×25/25）=250U（2）250÷0.625=400U/mg（3）0.625÷（1×25/25）×1×103=0.625×103mg=0.625g1500/60÷（0.1×25/25）÷（1×25/25）×103=2.5×105U14.有1g淀粉酶酶制劑，用水溶解成1000ml，從中取出1ml測定淀粉酶活力，測知每5min分解0.25g淀粉。計算每g酶制劑所含淀粉酶活力單位數？[3000U]（淀粉酶活力單位定義：在最適條件下每小時分解1g淀粉的酶量稱為1個活力單位）解：0.25/5×60÷（1/1000×1）=3000U15.某酶的初提取液經過一次純化后，竟測定得到下列數據：試計算比活力、百分產量及純化倍數。[比活力：180U/mg蛋白質，百分產量：17%，純化倍數：9倍]體積/ml活力單位/（U/ml）蛋白質/（mg/ml）初提取液（NH4）2SO4鹽析1205200810104解：（1）810/4.5=180U/mg（2）810×5÷（200×120）×100%=17%（3）180÷（200/10）=9第九章酶促反應動力學提要酶促反應動力學是研究酶促反應的速率以及影響此速率各種因素的科學。它是以化學動力學為基礎研究底物濃度、抑制劑、pH、溫度及激活劑等因素對酶反應速率的影響?；瘜W動力學中在研究化學反應速率與反應無濃度的關系時，常分為一級反應、二級反應及零級反應。研究證實，酶催化過正的第一步是生成酶-底物中間產物，Michaelis-Menten該呢舉中間產物學說的理論推導出酶反應動力學方程式，即Km、Vmax、kcat