次級淋巴組織趨化因子檢測胃癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移

1/1次級淋巴組織趨化因子檢測胃癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移次級淋巴組織趨化因子檢測胃癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移作者：

陳瑾賈忠封光華賀冠海羅中堯蔡陽謝琦方欣【摘要】［目的］探討次級淋巴組織趨化因子（SLC）mRNA聯(lián)合檢測預(yù)測淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移對胃癌病人的臨床意義。

［方法］分別用SLCmRNART-PCR方法、細(xì)胞角蛋白CK20免疫組化染色法、常規(guī)病理學(xué)方法檢測2003年至2006年間手術(shù)的35例胃癌病人的523個淋巴結(jié)。

［結(jié)果］14例胃癌患者63個淋巴結(jié)免疫組化和常規(guī)組織學(xué)檢查未證實(shí)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而SLCmRNA表達(dá)減弱，提示存在隱匿性轉(zhuǎn)移。

分化差的患者微轉(zhuǎn)移發(fā)生率高于分化好的患者。

［結(jié)論］SLCmRNA聯(lián)合細(xì)胞角蛋白CK20免疫染色以及常規(guī)組織學(xué)檢查可更準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移灶，有利于判斷胃癌病人的預(yù)后。

【關(guān)鍵詞】胃腫瘤微轉(zhuǎn)移細(xì)胞角蛋白次級淋巴組織趨化因子SecondaryLymphoidTissueChemokinemRNADeterminationofLymphNodeMicrometastasisinPatientswithGastricCancerAbstract:［Purpose］ToexplorethesignificanceofcombinedmeasurementofsecondarylymphoidtissuechemokinemRNAforpredictionmicrometastasisoflymphnodesinpatientswithgastriccancer.［Methods］Fivehundredandtwenty-threelymphnodesremovedfrom35caseswithgastriccancerduring2003to2008wereexaminedbyimmunohistochemistryofcytokeratinandSLCmRNART-PCR.［Results］In14cases(63lymphnodes)withgastriccancer,expressionofSLCmRNAwasreducedsuggestingunconfirmedmicrometastasiswithimmunohistochmicalmethodandroutinepathologicalmethod.Theincidenceofmicrometastasisinundifferentiatedcarcinomawashigherthanthatindifferentiatedcarcinoma.［Conclusion］Detectionoflymphnodemicrometastasisandaccuracypredictionofprognosisinpatientswithgastriccancershouldbegreatlyenhancedifcytokeratin-specificimmunohistochemstry,SLCmRNAandroutinehistopathologicalexaminationoflymphnodesarealladopted.Keywords:gastricneoplasms;micrometastasis;cytokeratin;secondarylymphoidtissuechemokine局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是判斷胃癌患者預(yù)后的最重要因素之一。

近年來，研究顯示在乳腺癌及結(jié)直腸癌患者常規(guī)HE染色陰性淋巴結(jié)中，分子生物學(xué)技術(shù)能夠發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)的隱匿性轉(zhuǎn)移，并顯示微轉(zhuǎn)移的存在直接影響乳腺癌及結(jié)直腸癌病人的預(yù)后，但對胃癌患者淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的意義尚有爭議，并引起許多學(xué)者的關(guān)注。

本文通過RT?鄄PCR和免疫組織化學(xué)染色法分別測定胃癌患者中次級淋巴組織趨化因子（secondarylymphoidtissuechemokine，SLC）SLCmRNA，細(xì)胞角蛋白來分析淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的存在，并評估聯(lián)合分子生物學(xué)方法在改善診斷的精確性及預(yù)測胃癌病人預(yù)后方面的臨床意義。

1材料及方法1.1標(biāo)本選取2003年1月~2006年3月期間行根治性切除的35例胃癌患者。

所有病人均無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

隨訪時間為3個月~4年。

35例病人共切取淋巴結(jié)523個，每個淋巴結(jié)的一半經(jīng)10%福爾馬林固定及石蠟包埋，每一蠟塊連續(xù)切取兩片4m厚組織，分別用作HE染色及細(xì)胞角蛋白特殊免疫染色,另一半組織迅速放入凍存管置液氮罐中保存，留待SLCmRNA的測定。

原發(fā)腫瘤及HE染色證實(shí)有轉(zhuǎn)移的5個淋巴結(jié)作為陽性對照，而另取胃良性病變的5個淋巴結(jié)作為陰性對照。

1.2角蛋白免疫組化染色采用鼠單克隆抗體CAM5.2的SAB免疫過氧化酶法。

先由有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)醫(yī)生在不知臨床病理信息的情況下對HE染色切片進(jìn)行有無轉(zhuǎn)移的觀察，然后與免疫組織化學(xué)染色切片結(jié)果比較。

當(dāng)HE染色漏診而免疫組化染色證實(shí)有淋巴結(jié)受累時，稱之為微轉(zhuǎn)移1。

1.3淋巴結(jié)SLCmRNA的測定用TRIZOL試劑RNA提取試劑盒(美國LifeTechnologies公司產(chǎn)品)提取總RNA，測定RNA純度及濃度并對其完整性進(jìn)行檢測，以總RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

SLC的PCR引物序列及擴(kuò)增條件參見Reape等[1]的報道。

上游引物5?鄄ATGGCTCAGTCACTGGCT?鄄3；下游引物5?鄄GGCCCTTTAGGGGTCTGT?鄄3(引物由中科院上海生理研究所合成)，反應(yīng)條件：

預(yù)變性94℃，5min，變性94℃，1min，退火55℃，1min，然后延伸72℃，30s，最后一次延伸72℃，5min，共30個循環(huán)。

產(chǎn)物片段為400bp，用3?鄄磷酸苷油醛脫氫酶G3PDH作內(nèi)參照，引物序列如下，上游引物：

5?鄄TCCCTCAAGATTGTCAGCAA?鄄3；下游引物:5?鄄AGATCCACAACGGATACATT?鄄3，產(chǎn)物片段為309bp。

分子量參照物為PGEM?鄄7Zf(+)/HaeⅢ。

結(jié)果觀察：

PCR產(chǎn)物在加溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，于紫外燈下觀察、照相，并進(jìn)行圖像分析，分析后的積分光度值均以同一樣本中相應(yīng)的G3PDH積分光度值校正，以淋巴結(jié)/正常組織(L/N)積分光度值的比值反映淋巴結(jié)中SLC表達(dá)的相對含量。

當(dāng)HE染色和免疫組化染色漏診，而淋巴結(jié)SLCmRNA積分光度值小于正常淋巴結(jié)均值的60%以下時為SLCmRNA表達(dá)減弱，稱之為微轉(zhuǎn)移2。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析用t檢驗(yàn)檢測原發(fā)腫瘤臨床病理特征與伴有隱匿性腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)數(shù)量之間的關(guān)系；GeneralizedWilmxon用于檢測其差異之間的顯著性意義。

P值小于0.05則具有顯著意義。

2結(jié)果2.1胃癌患者中微轉(zhuǎn)移的發(fā)生率在35例胃癌患者中，40%（14/35）患者淋巴結(jié)HE常規(guī)染色陰性而免疫組化染色發(fā)現(xiàn)有隱匿腫瘤細(xì)胞存在微轉(zhuǎn)移1（54個），占切取淋巴結(jié)總數(shù)的10%（54/523）。

所有35例原發(fā)腫瘤均發(fā)現(xiàn)對抗角蛋白單克隆抗體產(chǎn)生陽性免疫反應(yīng)。

為保證實(shí)驗(yàn)的可靠性，隨機(jī)選取5個經(jīng)傳統(tǒng)HE染色檢測出轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)作相應(yīng)免疫組化檢測，均呈陽性表達(dá)；相反，5個正常淋巴結(jié)，則均呈陰性表達(dá)。

胃癌患者不同組織的SLCmRNA積分光度值見表1。

免疫組化和常規(guī)組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)的325個淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)本，SLCmRNA測定均明顯減弱。

但SLCmRNA含量分析還同時發(fā)現(xiàn)14例(40%)的胃癌有63個淋巴結(jié)可能存在微轉(zhuǎn)移2，占切取淋巴結(jié)總數(shù)的12%（63/523）。

2.2微轉(zhuǎn)移發(fā)生與臨床病理特征關(guān)系由表2可見，病人的年齡、性別、腫瘤大小及淋巴管侵襲或血管侵襲均與微轉(zhuǎn)移的發(fā)生率無明顯關(guān)系。

而分化差的患者微轉(zhuǎn)移發(fā)生率較分化好的微轉(zhuǎn)移發(fā)生率顯著性增高(Plt;0.05)；浸潤性生長的腫瘤較膨脹性生長的腫瘤則更易發(fā)生微轉(zhuǎn)移(Plt;0.05)。

2.3隨訪與預(yù)后隨訪35例病人，7例病人死于腫瘤復(fù)發(fā)，其中3例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或腹膜種植轉(zhuǎn)移，2例血源性轉(zhuǎn)移，2例吻合口復(fù)發(fā)。

分析顯示7例患者均存在隱匿性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，其中3例存在微轉(zhuǎn)移1，4例存在微轉(zhuǎn)移2。

其余28例至今尚存活，并繼續(xù)系統(tǒng)治療。

3討論近年來，人們愈來愈關(guān)注惡性腫瘤淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的存在與預(yù)后的關(guān)系，并已發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、結(jié)直腸癌病人發(fā)生淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移時，5年生存率明顯降低[２，３]。

而對于胃癌病人區(qū)域淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移是否具有判斷病人預(yù)后的意義尚存在爭議。

近年來的研究證實(shí)：

在早期及進(jìn)展期胃癌病人的淋巴結(jié)中，可能存在孤立的癌細(xì)胞或小簇癌細(xì)胞團(tuán)，這些癌細(xì)胞很可能影響病人的預(yù)后，而且淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移可能是獨(dú)立的預(yù)后因子之一[４]。

SLC具有多種抗腫瘤特性并在胃癌淋巴管受侵和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中可能起了重要作用[5]；另一方面是由于淋巴管受侵可能是早期癌癥淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要預(yù)測因子。

我們的資料發(fā)現(xiàn)：

在35例胃癌病人中，14例病人淋巴結(jié)HE常規(guī)染色檢測陰性，而免疫組化染色發(fā)現(xiàn)有隱匿性腫瘤細(xì)胞，即微轉(zhuǎn)移1存在；而且，14例免疫組化染色陰性，而SLCmRNA顯示有表達(dá)明顯減弱的跡象，提示有可能存在隱匿的腫瘤細(xì)胞，即微轉(zhuǎn)移2。

這一結(jié)果也許可以解釋為什么HE常規(guī)染色和免疫組化染色均顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的病人仍然會死于腫瘤復(fù)發(fā)的原因。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的主要危險因素通常包括：

原發(fā)腫瘤的大小、腫瘤的生長方式以及腫瘤的分化程度和浸潤深度。

我們資料顯示：

一般浸潤性生長的腫瘤較膨脹性生長的腫瘤更易發(fā)生微轉(zhuǎn)移；腫瘤浸潤至漿膜下層時微轉(zhuǎn)移發(fā)生率較腫瘤局限在肌層內(nèi)時多見，但差異無顯著性。

許多文獻(xiàn)報道了胃癌病人存在著淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移，但對于預(yù)后意義的觀點(diǎn)不一。

多數(shù)研究為小樣本量的回顧性分析，而T3、T4期腫瘤常見的復(fù)發(fā)形式是腹膜種植，如果樣本中含有局部進(jìn)展期腫瘤，則腹膜復(fù)發(fā)會干擾淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移對預(yù)后的意義。

大樣本量的多因素分析或許能說明淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的作用，但淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與腹膜種植之間的明顯關(guān)系同樣會干擾多因素分析的結(jié)果。

我們以PT0~3N0~2M0期的胃癌病人作為研究對象，從而有利于對淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的預(yù)后意義作出更準(zhǔn)確的判斷。

有研究發(fā)現(xiàn)，胃癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移病人的5年生存率明顯低于無淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移者；多變量生存分析也表明淋巴結(jié)隱匿性癌細(xì)胞的存在可能是一個獨(dú)立的預(yù)后因子[４]。

在檢測方法中，不易檢測淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移顯然是傳統(tǒng)HE染色的缺陷，抗細(xì)胞角蛋白單克隆抗體CAM5.2的免疫染色被認(rèn)為是檢測淋巴結(jié)內(nèi)孤立或小簇腫瘤細(xì)胞的有效方法。

然而，上述方法依然不能預(yù)測淋巴結(jié)是否可能已經(jīng)存在微轉(zhuǎn)移，且用不同的抗體免疫組化檢測淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，結(jié)果可能出現(xiàn)差異[6]。

Sotiriou等[７]研究表明對乳腺癌組織的癌基因表達(dá)進(jìn)行測定有可能增強(qiáng)腫瘤分級的準(zhǔn)確性，提高其診斷價值；國內(nèi)學(xué)者的研究也證實(shí)運(yùn)用RT?鄄PCR法檢測某些癌基因來推斷淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移，其準(zhǔn)確性高于免疫組化檢測法[8]。

我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胃癌病人聯(lián)合SLCmRNA等分子生物學(xué)、免疫組化染色能檢測出HE染色陰性淋巴結(jié)中隱匿的癌細(xì)胞，并且有淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的病人術(shù)后復(fù)發(fā)的概率較無淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的病人更大,提示聯(lián)合分子生物學(xué)和細(xì)胞角蛋白免疫組化染色有助于發(fā)現(xiàn)常規(guī)HE檢測陰性的淋巴結(jié)中可能存在的微轉(zhuǎn)移。

【參考文獻(xiàn)】[1]ReapeTJ,RaynerK,ManningCD,etal.Expressionandcellular,localizationoftheCCchemokinesPARCandELCinhumanatheroscleroticplaques[J].AmJPathol,1999,154(2):365-374.[2]KuijtGP,VoogdAC,vandePoll?鄄FranseLV,etal．Theprognosticsignificanceofaxillarylymph?鄄nodemicrometastasesinbreastcancerpatients[J].EurJSurgOncol,2005,31(5):500-505.[3]desGuetzG,LacortesJM,Camilleri?鄄BroetS,etal．Micrometastasesincoloniccancers:diagnosticmethodsandprognosticelements[J]．JChir(Paris),2002,139(3):141-148.[4]NakamuraY,YasuokaH,TsujimotoM,