基因診斷與基因治療

基因診斷與基因治療第一節(jié)基因診斷疾病的根本原因:

疾病的各種表型的改變是基因的改變?cè)斐傻幕蛟\斷:

采用分子生物學(xué)的技術(shù)方法來分析受檢者的某一特定基因的結(jié)構(gòu)(DNA水平)或功能(RNA水平)是否異常，以此來對(duì)相應(yīng)的疾病進(jìn)行診斷。是病因的診斷。一、基因診斷(GeneticDiagnosis)的含義二、基因診斷的原理和方法1、基因診斷的原理：DNA診斷----檢測相關(guān)基因的機(jī)構(gòu)及其表達(dá)功能特別是RNA產(chǎn)物是否正常。RNA診斷----對(duì)表達(dá)產(chǎn)物mRNA質(zhì)和量表化的分析。1、基因診斷的方法核酸分子雜交技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)基因測序基因芯片（1）DNA診斷斑點(diǎn)雜交等位基因特異寡核苷酸探針

(allelespecificoligonucleotide,ASO)PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）

(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)限制性內(nèi)切酶譜分析法DNA限制性長度多態(tài)性

(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RLFP)分析PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正常基因和變異基因的遷移位置不同，可分析確定致病基因的存在。

×MstⅡ酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5′3′正常基因5′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析（2）RNA診斷RNA印跡（Northenblot）是檢測基因是否表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物mRNA的大小及基因表達(dá)的效率。RT-PCR三、基因診斷的應(yīng)用1、遺傳疾病2、感染性疾病（1）病毒性感染（2）細(xì)菌性感染（3）寄生蟲（4）其他3、惡性腫瘤4、法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用（1）DNA指紋分析（DNAfingerprinting）（2）短串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性分析（shorttandemrepeat，STR）遺傳性疾病----DMD的分子診斷

遺傳性疾病----DMD的分子診斷X染色體連鎖隱性遺傳性肌肉疾病,發(fā)病率為1/3500個(gè)男孩DMD基因位于Xp21.2-21.3，全長2500KbDMD基因的突變導(dǎo)致dystrophin缺陷檢測DMD基因的技術(shù)：

Southern印跡、多重PCRDMD的基因檢測

迪謝內(nèi)肌營養(yǎng)不良(DMD)是一種高發(fā)病率、高致殘、高致死的X染色體連鎖的遺傳性疾病，在2500個(gè)活產(chǎn)男嬰中即有一個(gè)患者。致病基因DMD的全長為250kb，有79個(gè)外顯子。

DMD的最主要遺傳缺陷是外顯子缺失，約占60%~70%。DMD基因外顯子缺失的檢測感染性疾病的分子診斷感染性疾病的分子診斷

定性或定量檢測致病微生物的核酸，已經(jīng)用于病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染的診斷。動(dòng)態(tài)、定量地檢測病原體核酸能對(duì)療效判斷和病情預(yù)后提供客觀的依據(jù)。

SARS相關(guān)冠狀病毒的分子診斷SARS相關(guān)冠狀病毒的分子診斷

2003年4月，香港研究者Peiris等報(bào)告了50例SARS病人的臨床表現(xiàn)和病毒學(xué)研究結(jié)果證明，新冠狀病毒可能是SARS的致病原因。（Lancet,2003,361:9365)

其它實(shí)驗(yàn)室陸續(xù)得出相同結(jié)論。

2003年4月，德國漢堡Bernhard-

Nocht熱帶醫(yī)學(xué)研究所學(xué)者Drosten

等用隨機(jī)擴(kuò)增技術(shù)，獲得長度為

300bp的核苷酸序列。根據(jù)這段序列，建立了檢測新冠狀病毒的常規(guī)和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)。（onApril10,2003）引物和探針

BNIoutS2--BNIoutAsBNI-1片段，189bp

BNIinS--BNIinAsBNI-1片段的內(nèi)套片段，108bpBNITMSARS1—BNITMSARAs2BNITMSARP(熒光素標(biāo)記的探針）產(chǎn)物長度：77bp

檢測標(biāo)本痰液、咽拭子、鼻拭子、支氣管肺泡灌洗液、血漿、糞便。檢測方法

1.逆轉(zhuǎn)錄-巢式PCR2.逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)PCR結(jié)果

病人和接觸者（具臨床癥狀）的痰液中用外套引物檢測到了病毒。病人的其它標(biāo)本用套式PCR檢測到病毒。

有報(bào)道顯示，在可能SARS病人中，病毒的檢出率為100%。在疑似SARS病人中的檢出率為

23%。所有健康接觸者中未檢測到病毒。

檢測病毒的3種方法（血清學(xué)檢測、病毒分離、PCR技術(shù)）中，PCR技術(shù)的檢出率最高。討論

疾病的早期即可獲得陽性結(jié)果（早于血清轉(zhuǎn)換期）。特異性較高（SARS患者中的陽性率約為80%，對(duì)照中的陰性率約為

98%~100%）?，F(xiàn)有的方法敏感性較差，陰性結(jié)果不能排除病毒感染。討論痰液中病毒RNA濃度極高，說明病毒從呼吸道排放是主要傳播途徑。血清中檢測到極低濃度的病毒RNA，提示病毒復(fù)制不僅發(fā)生于呼吸道。病人恢復(fù)晚期的糞便中存在病毒RNA，說明糞便可能也是一種傳播途徑。鼻、咽拭子中含有的病毒RNA顯著少于痰液，提示不適合作為標(biāo)本（有可能漏檢）。SARS相關(guān)冠狀病毒分子診斷中

必須注意的問題必須在規(guī)范的基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。應(yīng)采取必要的質(zhì)控規(guī)程，包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。陽性結(jié)果時(shí)必須對(duì)原始樣本重復(fù)檢驗(yàn)或者擴(kuò)增基因的另一個(gè)片段或在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)同一樣本進(jìn)行檢測。其他感染性疾病的診斷HBV病毒HIV病毒

PCR技術(shù)在細(xì)菌性食物中毒中的應(yīng)用簡介細(xì)菌性食物中毒具有下列特點(diǎn)：與飲食有密切關(guān)系，患者只局限在食用過同一種食物的人群中，去掉原因食品后，不再有新患者；臨床癥狀以急性胃腸炎為主要表現(xiàn)，癥狀基本相同；短時(shí)間內(nèi)有多人發(fā)??；無人傳染人的現(xiàn)象；有一定的地區(qū)性，主要與人們膳食習(xí)慣有關(guān)；有明顯的季節(jié)性，主要發(fā)生在夏秋季節(jié)，氣溫高細(xì)菌易于繁殖和產(chǎn)生毒素；從病人與食物中可分離出相同的病原菌。簡介細(xì)菌性食物中毒感染型食物中毒：由于細(xì)菌污染食物后在其中大量繁殖，人食入了含有大量活菌的食物后，引起消化道感染而造成的中毒，如沙門氏菌、副溶血性弧菌、變形桿菌、鏈球菌等。毒素型食物中毒：由于細(xì)菌污染食物后在其中繁殖并產(chǎn)生大量毒素，人食入含有大量毒素的食物后引起的中毒，如肉毒中毒。樣品采集剩余食物炊事用具嘔吐物糞便外環(huán)境樣品常規(guī)檢驗(yàn)程序(1-2星期)直接涂片、染色、鏡檢活菌數(shù)測定（少數(shù)菌）選擇適當(dāng)?shù)脑鼍b別培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)生化鑒定血清學(xué)試驗(yàn)毒素測定常見的致食物中毒的細(xì)菌沙門菌志賀菌O157副溶血性弧菌金黃色葡萄球菌蠟樣芽孢桿菌霍亂弧菌單核利斯特菌化膿性鏈球菌小腸結(jié)腸耶爾森氏菌變形桿菌空腸彎曲菌產(chǎn)氣莢膜梭菌致腹瀉性大腸桿菌樣品增菌直接處理選擇性培養(yǎng)基增菌DNA提取PCRPCR快速檢測致食物中毒的細(xì)菌M腫瘤相關(guān)基因的檢測腫瘤相關(guān)基因的檢測

腫瘤是由于遺傳物質(zhì)（腫瘤相關(guān)基因）發(fā)生突變而導(dǎo)致的疾病。腫瘤相關(guān)基因的突變只是增加了個(gè)體對(duì)腫瘤的易感性而并不一定馬上產(chǎn)生腫瘤，腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的過程。生物芯片技術(shù)在今后的腫瘤發(fā)病機(jī)制研究和腫瘤的診斷等方面將發(fā)揮越來越顯著的作用P53導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的機(jī)制TotalRNAfromHeLaorNCI-H23cellswerereverse-transcribedintocDNAsinthepresenceofBiotin-dUTP.Thebiotin-labeledcDNAprobeswerethenhybridizedindividuallytotheHumanTranSignalp53TargetGeneArray.p53TargetGeneArray法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用個(gè)人認(rèn)識(shí)親子鑒定性別鑒定第二節(jié)基因治療一、基因治療的概念1、基因治療的定義：從基因角度：對(duì)缺陷的基因進(jìn)行修復(fù)將正常有功能的基因置換增補(bǔ)缺陷基因從治療角度導(dǎo)入基因以改變患者細(xì)胞的基因表達(dá)導(dǎo)入基因：缺陷基因相對(duì)應(yīng)的有功能的同源基因缺陷基因無關(guān)的治療基因基因治療的兩種形式體細(xì)胞基因治療種系基因治療只限于某一體細(xì)胞的基因的改變只限于某個(gè)體的當(dāng)代對(duì)缺陷的生殖細(xì)胞進(jìn)行矯正當(dāng)代及子代2、基因治療的方式基因矯正或置換基因增補(bǔ)基因封閉其他3、導(dǎo)入的方式體外導(dǎo)入（exvivo）體外將基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)再將這種基因修飾過的細(xì)胞回輸病人體內(nèi)使這種帶外源基因的細(xì)胞在體內(nèi)表達(dá)達(dá)到治療或預(yù)防的目的體內(nèi)導(dǎo)入（invivo）外源基因直接導(dǎo)入體內(nèi)有關(guān)的組織細(xì)胞使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并表達(dá)基因治療的基本程序治療性基因的選擇基因載體的選擇靶細(xì)胞的選擇基因轉(zhuǎn)移外源基因表達(dá)的篩選

利用在體中的標(biāo)記基因回輸體內(nèi)病毒載體非病毒載體體細(xì)胞生殖細(xì)胞間接體內(nèi)療法直接體內(nèi)療法二、治療的基因的選擇目前臨床試驗(yàn)的治療基因：

合適的能達(dá)到治療/預(yù)防的目的基因的cDNA(表21-1)目的基因的cDNA的獲得cDNA文庫中目的基因的克隆人工合成基因片段PCR法篩選擴(kuò)增目的基因

三、載體系統(tǒng)--運(yùn)送基因的工具病毒載體非病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體腺病毒腺相關(guān)病毒其他脂質(zhì)體裸DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期進(jìn)入宿主細(xì)胞

雙鏈RNA

逆轉(zhuǎn)錄酶

雙鏈DNA前病毒

整合到宿主細(xì)胞基因組DNA中宿主細(xì)胞RNA聚合酶IImRNA

病毒RNA基因組作為合成相應(yīng)

病毒蛋白質(zhì)的模板包裝成新的病毒顆粒，離開宿主LTRgagpolenvφLTR長末端重復(fù)序列調(diào)節(jié)和啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生病毒核心蛋白產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生病毒外膜蛋白包裝信號(hào)DNA前病毒的結(jié)構(gòu)特征逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建常用的是莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMLV)構(gòu)建的各類逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LTRgagpolenvφLTR長末端重復(fù)序列調(diào)節(jié)和啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄包裝信號(hào)目的基因標(biāo)記基因LTRgagpolenvLTRGag蛋白PoL蛋白Env蛋白包裝細(xì)胞系LTRLTR靶細(xì)胞目的基因標(biāo)記基因LTRφLTR目的基因標(biāo)記基因12345假病毒顆粒的產(chǎn)生并感染靶細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒載體重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(核酸部分只能是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)輔病毒四、基因治療的臨床試驗(yàn)當(dāng)前基因治療試驗(yàn)：治療性試驗(yàn)基因標(biāo)記非治療性試驗(yàn)治療性試驗(yàn)1、基因標(biāo)記2、單基因疾病3、惡性腫瘤（1）免疫基因治療（2）自殺基因系統(tǒng)（3）抑癌基因（4）裂解腫瘤病毒4、病毒性感染5、心血管疾病遺傳性單基因疾病腺苷脫氨酶(ADA)缺乏的

嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)腺苷脫氨酶(ADA)缺乏的

嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)病因:淋巴細(xì)胞缺乏ADA酶腺苷、dATP堆積破壞免疫功能