(高清版)DB12∕T 1328-2024 畜禽養(yǎng)殖糞污中典型致病菌檢測 三重?cái)?shù)字PCR法

12Detectionoftypicalpathogenicbacteriainlivestockwaste—TripledigitalPCRI本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定1畜禽養(yǎng)殖糞污中典型致病菌檢測三重?cái)?shù)字PCR法本文件規(guī)定了畜禽養(yǎng)殖糞污中典型致病菌的三重?cái)?shù)字PCR檢本文件適用于天津市畜禽養(yǎng)殖糞污中金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157:H7、沙門氏菌的快速定GB/T6682—2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試GB/T25171—2023畜禽養(yǎng)殖環(huán)境與廢棄物管理術(shù)語GB/T27403—2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)GB/T27522—2023畜禽養(yǎng)殖污水監(jiān)測技SN/T4853轉(zhuǎn)基因大米定量檢測SN/T5334.1—2020轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的數(shù)字PCR檢測方法第1部分：通GB/T25171—2023、SN/T5334.1—2020界定的術(shù)語和定義適用于本文微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)采用毛細(xì)通道網(wǎng)格將數(shù)萬個(gè)微滴離散進(jìn)入2D芯片，從而有效地實(shí)現(xiàn)反應(yīng)體系的基因序列對畜禽養(yǎng)殖糞污中典型致病菌進(jìn)行檢測。在PCR擴(kuò)增后，通過泊松分布校正陽性微滴的數(shù)量和比例，可以準(zhǔn)確計(jì)算靶基因序列的起始拷貝數(shù)或濃度，從而同d）高速冷凍離心機(jī)：控溫4℃8℃,離心力不小于12000g/min；2h）恒溫振蕩搖床：控溫28℃±1℃37℃±1℃,轉(zhuǎn)速在125r/min250r/min；6.1除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682—2008規(guī)定的一級水。c)裂解液：2%CTAB(cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨)，100mmol/LEDTA(ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸)，用HCl調(diào)至pH6.3.1金黃色葡萄球菌nuc基因引物和探針nuc上游引物：5’-CCTGAAGCAAGTGCATTTACGA-3’nuc下游引物：5’-CTTTAGCCAAGCCTTGACGAACT-3’nuc探針：5’-（HEX）-TGGACGTGGCTTAGCGTATATTTATGCTGATG-（BHQ1）-3’6.3.2大腸埃希氏菌O157:H7rfbE基因引物和探針rfbE上游引物：5’-TCAAAAGGAAACTATATTCAGAAGTTTGA-3’rfbE下游引物：5’-CGATATACCTAACGCTAACAAAGCTAA-3’rfbE探針：5’-（CY5）-AATAAATTTGCGGAACAAAACCATGTGCAA-（BHQ3）-3’6.3.3沙門氏菌的FimY基因引物和探針FimY上游引物：5’-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3’FimY下游引物：5’-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3’FimY探針：5’-（FAM）-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-（BHQ1）-3’3采樣容器應(yīng)經(jīng)121℃、20min高壓滅菌或使用一次性無菌器具。其余采用所用工具、文具和安全防護(hù)用品等應(yīng)按照GB/T27522—2023中第參照GB/T36197進(jìn)行畜禽養(yǎng)殖糞污樣品在運(yùn)輸過程中應(yīng)4℃以下保存并及時(shí)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室檢測。如當(dāng)日送樣不能及時(shí)檢測，應(yīng)將樣品放中，保存在-20℃?zhèn)溆?。陽性對照樣品也?yīng)采取上述DNA制備DNA濃度的測量方法和對DNA模板濃度的要求應(yīng)符合SN/T在試劑配制區(qū)進(jìn)行ddPCR體系配置。畜禽養(yǎng)殖糞污中同時(shí)檢測金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌4陽性標(biāo)準(zhǔn)品：含有金黃色葡萄球菌nuc基因、大在樣本制備區(qū)進(jìn)行，利用微滴生成擴(kuò)增系統(tǒng)完個(gè)循環(huán)；4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。整體反應(yīng)期間升降溫度速度均為利用微滴閱讀分析系統(tǒng)對數(shù)字PCR反應(yīng)進(jìn)行熒光信息采5——畜禽糞污樣品中某一典型致病菌含量（拷貝數(shù)/mL1——提取DNA的終體積(μL2——ddPCR反應(yīng)體系中加入的DNA模板體積(μL——DNA模板的稀釋倍數(shù)葡萄球菌。根據(jù)公式（1）計(jì)算樣品中金黃色葡萄球檢測過程中防止交叉污染的措施應(yīng)按照GB/T27403—2008中附錄D的規(guī)定執(zhí)行。應(yīng)由具備資格的工三重微滴式數(shù)字PCR檢測三種致病菌的定量方法檢測限分別為：沙門氏菌6.97copies/μL；金黃色葡萄球菌7.57copies/μL；大腸埃希氏菌O157:H77.66cop