生物技術(shù)教學大綱

生物技術(shù)實驗BiotechnologyExperiment一、課程性質(zhì)和任務(wù)生物技術(shù)實驗是基礎(chǔ)醫(yī)學實驗教學的重要組成部分，內(nèi)容涵蓋分子生物學、生物化學、醫(yī)學遺傳學、細胞生物學、醫(yī)學免疫學等學科領(lǐng)域中常用的基本操作技術(shù)?，F(xiàn)代醫(yī)學的高速發(fā)展，要求學生不僅要有較高的理論水平，還要有較強的科研能力。通過生物技術(shù)實驗教學，使學生掌握了蛋白質(zhì)分離純化與含量測定、核酸提取分離純化與含量測定、分子雜交、基因擴增、細胞培養(yǎng)與傳代等技術(shù)原理和基本操作。培養(yǎng)學生科研工作的基本能力、從事科學研究的意識和嚴謹?shù)目茖W態(tài)度，提高學生實驗動手能力和解決問題的能力。同時以科研促進教學，將科研方面取得的、成熟的新實驗技術(shù)引入學生實驗教學中，進一步增強學生的實驗技能，提高學生實踐能力、思維能力和創(chuàng)新能力。二、基本內(nèi)容和要求1、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)基本內(nèi)容：聚丙烯酰胺凝膠電泳,是在區(qū)帶電泳原理的基礎(chǔ)上，以孔徑大小不同的聚丙烯酰胺凝膠作為支持物，采用電泳基質(zhì)的不連續(xù)體系（即凝膠層的不連續(xù)體系、緩沖液離子成分的不連續(xù)性、pH的不連續(xù)性及電位梯度的不連續(xù)性），使樣品在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮成薄的起始區(qū)帶（厚度1—2mm），然后再進行電泳分離?；疽螅赫莆站郾０纺z電泳的基本原理，熟悉聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術(shù)。2、葡聚糖凝膠層析分離蛋白質(zhì)基本內(nèi)容：凝膠層析法是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種方法，又稱分子篩層析法，排阻層析法。凝膠本身是一種分子篩，它可以把分子按大小不同進行分離。在洗脫過程中，大分子不能進入凝膠內(nèi)部（阻滯作用?。┒啬z顆粒間隙最先流出柱外，而小分子可以進入凝膠內(nèi)部（阻滯作用大），流程長，流速緩慢，最后流出柱外，從而使樣品中分子大小不同的物質(zhì)得到分離?；疽螅赫莆掌暇厶悄z層析分離蛋白質(zhì)的方法，了解核酸—蛋白檢測儀及部分收集器的工作原理和使用。3、動物組織細胞內(nèi)DNA的分離和含量測定基本內(nèi)容：用適當方法將細胞破碎，使DNA處于易被抽提的狀態(tài)，從脂類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)中將DNA分離出來并去除RNA。DNA堿基中含有的共軛雙鍵對紫外光有強烈的吸收，用波長260nm紫外光與標準DNA比色測定，即可求出樣品中DNA的含量。基本要求：熟悉從新鮮動物組織中分離DNA的方法，掌握用紫外分光光度法測定DNA含量。4、酵母蔗糖酶米氏常數(shù)（Km）的測定基本內(nèi)容：蔗糖酶在pH5.0緩沖液中與不同濃度的蔗糖混合，恒溫培養(yǎng)，經(jīng)過規(guī)定時間生成一定數(shù)量的還原糖。還原糖在堿性溶液中與硫酸銅共熱使二價銅（Cu2+）還原生成氧化亞銅，氧化亞銅再使磷鉬酸還原成鉬藍，用分光光度法測定鉬藍，并進而判定還原糖的生成量，以此代表反應(yīng)開始階段的初速度（V）然后以不同底物濃度的倒數(shù)按林—貝氏作圖法，從橫軸上截距求出Km值?；疽螅毫私獾孜餄舛葘Ψ磻?yīng)速度的影響及Km值的意義，掌握蔗糖酶Km的測定方法。5、Vc的性質(zhì)、含量測定基本內(nèi)容：還原型抗壞血酸還原染料2，6-二氯酚靛酚，該染料在酸性中呈紅色，被還原后紅色消失。還原型抗壞血酸還原2，6-二氯酚靛酚后，本身被氧化成脫氫抗壞血酸。在沒有雜質(zhì)干擾時，一定量的樣品提取液還原標準2，6-二氯酚靛酚的量與樣品中所含維生素C的量成正比?；疽螅毫私饩S生素C的主要性質(zhì)，學會測定蔬菜和水果中維生素C含量的方法。6、Lowry氏法測定蛋白質(zhì)含量基本內(nèi)容：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復合物，F(xiàn)olin-酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物），在一定的條件下，藍色深度與蛋白的量成正比。在500nm處測定樣品吸光值，確定其蛋白質(zhì)含量?；疽螅簩W習Lowry氏法測定蛋白質(zhì)的原理和方法，掌握分光光度法?；疽螅毫私鉁囟?、pH、激活劑、抑制劑對酶活性的影響，學習酶活性的判定。7、人類非顯帶染色體核型分析基本內(nèi)容：利用顯微照相裝置拍攝人類非顯帶染色體的圖像，并且將其放大成染色體照片;然后根據(jù)國際上統(tǒng)一的標準，按染色體的長短、著絲粒的位置、隨體的有無等指標，將人類的46條染色體分成7個組并編上號,最后再將染色體剪貼到專門的實驗報告單上，從而制成染色體核型(karyotype)圖，并檢查正常與否。這個過程就稱為核型分析。利用核型分析可以檢查人體的染色體數(shù)目是否正常，并可發(fā)現(xiàn)較大的染色體畸變以及判定性別等?；疽螅菏煜ふＨ祟惾旧w的數(shù)目及形態(tài)特征，掌握非顯帶染色體的核型分析方法。8、X染色質(zhì)制備與觀察基本內(nèi)容：正常女性的間期細胞核中緊貼核膜內(nèi)緣有一個染色較深的橢圓形小體，即X染色質(zhì)。通過采取口腔黏膜細胞作為檢查材料，經(jīng)染色后可進行觀察?；疽螅菏煜染色質(zhì)標本的制作方法，掌握細胞核染色方法。9、小鼠骨髓染色體制作及觀察基本內(nèi)容：小鼠骨髓細胞中的造血干細胞是生成各種血細胞和原始細胞，具有高度的分裂能力，本實驗采用這一材料，通過前處理，低滲，固定，制片，染色等步驟制得染色體標本，可觀察到許多處于分裂中期的染色體，可以進行染色體組型分析?；疽螅赫莆談游锕撬枞旧w標本制備基本過程、原理。10、PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳基本內(nèi)容：聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）是利用DNA聚合酶依賴于DNA模板的特性，在體外模擬DNA的復制過程，經(jīng)過變性、復性、延伸三個過程，在一對附加的引物之間誘發(fā)聚合反應(yīng)，短時間內(nèi)可將要研究的目的DNA擴增數(shù)百萬倍。基本要求：了解PCR技術(shù)的原理，掌握PCR技術(shù)的程序和步驟。11、擴散反應(yīng)基本內(nèi)容：用一定濃度的瓊脂制成凝膠后，其內(nèi)部形成一種多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可允許大分子物質(zhì)通過?？扇苄钥乖c抗體在瓊脂糖凝膠自由擴散后形成沉淀?；疽螅赫莆湛乖贵w定性沉淀反應(yīng)原理，了解IgG等免疫球蛋白的定量檢測技術(shù)。12、對流免疫電泳基本內(nèi)容：對流免疫電泳是雙向瓊脂擴散和電泳技術(shù)相結(jié)合的實驗技術(shù)。抗原在堿性緩沖液中帶負電，向正極移動；抗體蛋白質(zhì)較大，負電荷少，借電滲作用緩慢移向負極，在適當?shù)臈l件下，可形成抗原抗體反應(yīng)而出現(xiàn)沉淀?；疽螅赫莆湛乖贵w在電場中的反應(yīng)條件；熟悉對流免疫基本技術(shù)。13、血型測定和免疫妊娠膠體金間接凝集基本內(nèi)容：用膠體金標記技術(shù)，檢測尿中有無HCG。首先將鼠抗人HCG的單克隆抗體（一抗）吸附在膠體金顆粒上（膠體金呈紫紅色散在顆粒狀，肉眼可見）并松弛地附著在A處。鼠抗人HCG（一抗）及兔抗鼠Ig（二抗）分別吸附在檢測線B處及陽性對照線（C處）的硝酸纖維膜上。當尿液通過毛細作用上行時，尿中的HCG與A處的抗HCG膠體金結(jié)合，并且HCG—抗HCG—膠體金繼續(xù)上行至檢測線B處，并與B處的抗HCG發(fā)生反應(yīng)，形成雙抗體夾心免疫復合物，抗體Fc段標有膠體金，即成清晰的紫紅色。基本要求：通過檢測尿中有無HCG，掌握膠體金技術(shù)的原理。14、免疫熒光實驗基本內(nèi)容：根據(jù)抗原抗體反應(yīng)原理，將已知的抗體或抗原分子標記上熒光素，與相應(yīng)的抗原或抗體起反應(yīng)，從而使形成的抗原抗體復合物攜帶上一定量的熒光素，利用熒光顯微鏡可看出發(fā)出熒光的抗原抗體的結(jié)合物?；疽螅毫私饷庖邿晒鈱嶒灥幕驹恚莆諢晒饷庖呋緦嶒灱夹g(shù)。15、淋巴細胞轉(zhuǎn)換實驗基本內(nèi)容：正常機體的T淋巴細胞在體外培養(yǎng)過程中受到有絲分裂原刺激，可轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞。目前最常用植物血凝素（PHA）和刀豆素A（ConA）作為分裂原來檢測受試者的淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，從而判定其細胞免疫功能。細胞免疫缺陷時，患惡性腫瘤或某些其他疾病時，轉(zhuǎn)化率顯然降低。稱為淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗?；疽螅毫私庥薪z分裂原刺激淋巴細胞轉(zhuǎn)化活性，掌握淋巴細胞分離與培養(yǎng)技術(shù)，熟悉淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率計算。16、ELISA法檢測白細胞介素2基本內(nèi)容：IL-2主要是由活化的T細胞產(chǎn)生，在機體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮主要作用。它有較強的自分泌性和旁分泌性，能促進T細胞NK細胞增殖及活化、誘導LAK和TIL細胞的產(chǎn)生，參與B細胞增殖及活化等作用。IL-2產(chǎn)生水平反映了T細胞的功能。本試驗是采用兩株識別不同表位的抗IL-2mAb，其中一株作為包被抗體，以識別和結(jié)合待檢標本中的IL-2，另一株作為酶標抗體，與結(jié)合于包被抗體上的IL-2的另一表位結(jié)合，并催化底物呈色?；疽螅赫莆沼妹嘎?lián)免疫吸附的方法檢驗可溶性抗原分子的技術(shù)，了解細胞因子的檢測手段。17、小鼠巨噬細胞吞噬實驗基本內(nèi)容：吞噬細胞分小吞噬細胞、大吞噬細胞。前者為外周血中的中性粒細胞，后者包括外周血的單核細胞和組織中的巨噬細胞。檢測其功能，有助于疾病的診斷和判斷機體非特異性免疫水平?；疽螅赫莆沾笸淌杉毎淌晒δ軝z測方法，熟悉機體非特異免疫功能。三、學時分配：序號內(nèi)容實驗學時1聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)82葡聚糖凝膠層析分離蛋白質(zhì)83動物組織細胞內(nèi)DNA的分離和含量測定44酵母蔗糖酶米氏常數(shù)（Km）的測定45Vc的性質(zhì)、含量測定46Lowry氏法測蛋白質(zhì)含量47人類非顯帶染色體核型分析48X染色質(zhì)制備與觀察49小鼠骨髓染色體制作及觀察410PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測411單雙擴散212對流免疫電泳213血型測定和免