基因測序(一代測序和二代測序)-用于臨床疑難病原體鑒定

基因測序（一代測序和二代測序）用于臨床疑難病原體鑒定一、一代測序序用于臨床疑難病原體鑒定（可培養(yǎng)疑難病原體）人口不斷老齡化，器官移植和骨髓移植患者增多，免疫抑制劑和抗腫瘤等藥物大量使用，侵襲性操作不斷增加，細(xì)菌真菌嚴(yán)重感染患者不斷增加，臨床微生物檢驗的標(biāo)本量不斷增加。部分培養(yǎng)出的細(xì)菌或真菌通過傳統(tǒng)生化反應(yīng)、表型方法、自動化鑒定儀器、目前先進(jìn)的質(zhì)譜儀，憑借豐富的臨床經(jīng)驗，仍然難以準(zhǔn)確鑒定。一代測序，一次測序一個基因，片段>1000bp，約30元/樣本。我們2010年以來，將一代測序技術(shù)應(yīng)用于臨床疑難細(xì)菌真菌鑒定，取得較好效果并發(fā)表SCI論著1篇。第一部分將結(jié)合我們的工作進(jìn)行介紹。二、二代測序用于臨床疑難病原體鑒定（難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)病原體）有些病原體難于培養(yǎng)或不可培養(yǎng)，少部分細(xì)菌和真菌，大部分病毒、螺旋體、衣原體、寄生蟲。二代測序，一次測序多個基因，片段200~500bp，可對各類臨床樣本直接二代測序，可得到數(shù)百萬條基因片段，難在測序結(jié)果的生物信息學(xué)分析，約3000元/樣本。一、基因測序用于臨床疑難病原體鑒定（可培養(yǎng)疑難病原體，一代測序）（一）難鑒定細(xì)菌真菌一代測序方法（二）難鑒定細(xì)菌一代測序案例（三）難鑒定真菌一代測序案例（一）難鑒定細(xì)菌真菌一代測序方法細(xì)菌核糖體基因結(jié)構(gòu)特征16S

rRNA編碼基因約1500bp，包含約50個功能域。為細(xì)菌分類的金標(biāo)準(zhǔn)，由可變區(qū)和保守區(qū)組成。保守區(qū)為細(xì)菌共有，可變區(qū)有屬或種特異性。真菌核糖體基因結(jié)構(gòu)特征18S

RNA基因、5.8SrDNA、28S

RNA基因較保守，不適合區(qū)分不同屬種。間隔區(qū)ITSl、5.8S

rDNA和間隔區(qū)ITS2在不同真菌屬及種間表現(xiàn)出較高的差異，目前已用于真菌分類鑒定和分子檢測，以ITS2應(yīng)用最廣泛。細(xì)菌真菌DNA快速提取TaKaRa公司試劑盒（Lysis

Buffer

forMicroorganism

toDirect

PCR）。試劑盒中裂解緩沖液可以對G-菌、G+菌、酵母菌、霉菌等裂解，釋放其基因組DNA，結(jié)核桿菌、放線菌、諾卡菌也取得較好效果。粗制模板可直接用于PCR反應(yīng)，節(jié)省時間，但粗制模板可能含有抑制PCR的成分。細(xì)菌真菌核糖體基因PCR擴(kuò)增細(xì)菌通用引物序列：ccagcagccgcggtaatacg和atcgg(c/t)taccttgttacgacttc，擴(kuò)增16S

rRNA基因，片段996bp。真菌通用引物序列：gtgaatcatcgaatctttgaac和tcctccgcttattgatatgc，擴(kuò)增ITS2基因，片段194bp-494bp。經(jīng)電泳檢測，PCR產(chǎn)物條帶亮（產(chǎn)量高），無雜帶（純度高）。提供100μlPCR產(chǎn)物、擴(kuò)增用引物，送公司測序。公司負(fù)責(zé)PCR產(chǎn)物純化及濃縮，雙向測序，序列拼接，網(wǎng)上接收測序結(jié)果電子版。PCR產(chǎn)物序列blastn分析流程PCR產(chǎn)物由華大基因科技公司等進(jìn)行商業(yè)測序，所得測序結(jié)果在GenBank進(jìn)行blastn。比對細(xì)菌的16SrRNA基因，相同性（identity）百分比大于99

可以定義到種的水平，97～99可以定義到屬的水平，小于97有可能是一個新種。真菌ITS2序列分析，相同性（identity）百分比大于99可以定義到種的水平。一代測序用于臨床疑難病原菌鑒定我們2010年以來，將一代測序技術(shù)應(yīng)用于臨床疑難細(xì)菌真菌鑒定，取得較好效果并發(fā)表SCI論著1篇。國內(nèi)外首次報道臨床感染細(xì)菌2種，國內(nèi)首次報道臨床感染細(xì)菌10種、真菌2種。（二）難鑒定細(xì)菌一代測序案例加強(qiáng)生物安全防護(hù)

24烘片機(jī)抗酸染色陽性結(jié)果需注意國內(nèi)部分統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，抗酸染色陽性>80為結(jié)核分枝桿菌，需轉(zhuǎn)院到結(jié)核病?？漆t(yī)院治療。約5~20

為非結(jié)核分支桿菌，用藥與抗癆治療不同。建議將抗酸染色陽性結(jié)果及時與臨床醫(yī)生溝通，對該標(biāo)本加做結(jié)核分枝桿菌熒光定量PCR檢測，及時區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌。WHO推薦GeneXpert效果最佳多重?zé)晒舛縋CR及熔解曲線法原理?？焖偃詣訖z測各類標(biāo)本中結(jié)核桿菌、非典型分枝桿菌、利福平耐藥基因。結(jié)核分枝桿菌測序圖龜分枝桿菌測序圖諾卡菌屬測序圖放線菌測序圖放線菌用藥治療生氮二氧化碳嗜纖維菌測序圖難鑒定細(xì)菌分子診斷案例血液中分離出生痰二氧化碳嗜纖維菌（Capnocytophaga

sputigena），G-球菌，是人類口腔的正常菌群，屬于條件致病菌，常通過口腔粘膜進(jìn)入血液，感染者大多患有血液系統(tǒng)惡性腫瘤或粒細(xì)胞減少等疾病。該例敗血癥患者男性，診斷為地中海貧血，來自小兒科層流病房。根癌農(nóng)桿菌測序圖難鑒定細(xì)菌分子診斷案例血液中分離出根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）

，G-桿菌，普遍存在于土壤，生活在植物根的表面，依靠根組織滲透的營養(yǎng)物質(zhì)生存，能誘發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤。該例敗血癥患者20歲，女性，診斷為急性胰腺炎，來自消化內(nèi)科。有些不同屬種的細(xì)菌可能有著相同的16S

rRNA基因序列，如布魯氏菌和人蒼白桿菌。增加16S-23S

rRNA

基因間隔區(qū)測序：因變異性大可用于16S

rRNA基因不能鑒別的非常接近的不同屬種或同一屬不同種的鑒定。但有些不同屬種仍然不能區(qū)分。增加病原菌其他特異基因測序增加病原體其他特異基因測序：檢索文獻(xiàn)不同病原體選取不同特異基因，如布魯氏菌表面蛋白o(hù)mp31基因擴(kuò)增、測序及序列分析。無菌性標(biāo)本可直接擴(kuò)增16S

rRNA基因并測序。也可直接擴(kuò)增病原體特異基因并測序。增加病原菌其他特異基因測序（三）難鑒定真菌一代測序案例報警陽性血液涂片報警陽性血液涂片報警陽性血液涂片馬爾尼菲青霉菌測序圖難鑒定真菌分子診斷案例馬爾尼菲青霉菌（Penicillium

marneffe），常感染艾滋病患者，本病多見于東南亞。該例敗血癥患者39歲，男性，艾滋病抗體陽性，以肺炎收治于感染科。黑曲霉菌測序圖難鑒定真菌分子診斷案例黑曲霉菌（Aspergillus

niger），標(biāo)本來源是患者耳部膿液。該例患者25歲，女性，就診于耳鼻喉門診，診斷為慢性化膿性中耳炎，國內(nèi)文獻(xiàn)報道耳部感染的主要病原真菌是黑曲霉菌。黃曲霉菌測序圖鐮孢菌測序圖難鑒定真菌分子診斷案例鐮孢菌（Fusarium），標(biāo)本來源是眼部分泌物。該例患者48歲，女性，診斷為角膜炎，來自眼科。我國鐮孢菌所引起的真菌性角膜炎占真菌性角膜炎體的近40％。二、基因測序用于臨床疑難病原體鑒定（難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)病原菌，二代測序）PMseq?病原微生物快速檢測是華大基因的產(chǎn)品，是國內(nèi)第一家產(chǎn)品，基于二代高通量測序平臺，通過微生物專用數(shù)據(jù)庫（近7000種病原體）進(jìn)行比對分析，經(jīng)過智能化算法獲得疑似致病微生物的種屬信息，提供全面深入的報告參數(shù)輔助臨床診療決策。1個樣品3000元以上。二代測序流程RNA病毒也可建庫7000種病原體分析區(qū)分致病菌污染菌樣本收集保存轉(zhuǎn)運二代測序百萬序列可檢測病原種類種類數(shù)量/種細(xì)菌2328真菌199病毒4189寄生蟲135分枝桿菌（結(jié)核和非結(jié)核）83支原體/衣原體41病毒有DNA病毒和RNA病毒之分，如懷疑流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠狀病毒等RNA病毒，需要注意送檢RNA檢測流程。華大基因二代測序可檢測病原體近7000種可檢測病原種類種類數(shù)量/種細(xì)菌5682真菌812病毒7098寄生蟲138分枝桿菌（結(jié)核和非結(jié)核）94衣原體85支原體96立克次氏體90迅敏康IngeniGen公司二代測序可檢測病原體14000多種二代測序適用范圍疑難危重感染、長期發(fā)熱待查、血流感染、腦炎腦膜炎、重癥肺炎、腹瀉等。常規(guī)臨床細(xì)菌真菌檢驗無法明確病原體的疑難病例可考慮二代測序。二代測序適用范圍血漿、痰液、肺泡灌洗液、腦脊液、糞便、組織塊等各類標(biāo)本，無菌采集標(biāo)本。盡量避免采集污染，以免分析后得到大量污染病原菌的基因片段。按要求保存標(biāo)本并盡快送檢，盡量減少病原體基因降解。二代測序優(yōu)勢（提高陽性率）華大基因二代測序樣本數(shù)據(jù)初步總結(jié)血流感染：從傳統(tǒng)血培養(yǎng)陽性率12~15，到高通量測序陽性率30~35。腦炎/腦膜炎：從傳統(tǒng)培養(yǎng)法陽性率8~10，到高通量測序陽性率25~30。上述樣本主要來自疑難感染病例，故存在選樣偏倚，還可能存在假陽性，但仍體現(xiàn)了二代測序的優(yōu)勢。二代測序優(yōu)勢（快速篩查病毒感染）二代測序案例分析新英格蘭醫(yī)學(xué)期刊14歲聯(lián)合免疫缺陷綜合征男孩8個月2013年波多黎各旅行回國后入院，腦膜炎住院，發(fā)展為腦積水和癲癇狀態(tài)38項

感染病原檢測(6周之內(nèi))5種

抗生素先后聯(lián)用診斷不清、治療無效、束手無策二代測序案例分析48小時完成腦脊液標(biāo)本二代測序提示鉤端螺旋體感染475條序列，占比0.016%改用青霉素治療32天男孩痊愈出院二代測序案例分析共得到序列數(shù)3,063,784二代測序過程PCR擴(kuò)增選擇性，可丟失大量病原體片段二代測序案例分析區(qū)分致病菌與污染菌一代測序驗證及分型二代測序案例分析D為高濃度青霉素治療一周J電鏡無病毒E至I病理無分支桿菌無真菌ABC為治療前核磁共振結(jié)果二代測序優(yōu)勢對于疑難感染病例，提供快速精準(zhǔn)診斷依據(jù)。無偏性病原體廣覆蓋（細(xì)菌，真菌，病毒，寄生蟲），可以檢測更多臨床標(biāo)本類型，靈敏度高。深入提供病原鑒定分型、耐藥基因和毒力因子分析。以序列為基礎(chǔ)，可快速發(fā)現(xiàn)新發(fā)病原體，并進(jìn)行溯源分類。二代測序存在污染問題測序結(jié)果中常常含有多種病原體的基因片段，可能是標(biāo)本采集、運輸中污染，可能是各種試劑中存在污染。如何準(zhǔn)確判斷引起感染的病原體是難題，一般是濾掉皮膚表面常見正常菌群，增加一代測序重復(fù)驗證、血清學(xué)、病理學(xué)、電鏡等檢查。二代測序存在污染問題也有報道認(rèn)為即使無菌的腦脊液等標(biāo)本中也許存在正常菌群，尚需進(jìn)一步研究。急需建立二代測序在病原體中應(yīng)用的專